从转基因幼鼠脑组织中培养荧光兴奋性神经元

摘要

来源：Turko, P.，等。通过荧光激活细胞分选建立纯化的GABA能或谷氨酸能神经元的原代细胞培养。视觉实验杂志 （2019）

该视频展示了一种从转基因幼鼠的皮层和海马组织中培养荧光标记的GABA能和谷氨酸能神经元的技术。该过程包括获取纯化的神经元单细胞悬液，根据荧光蛋白的表达对GABA能神经元进行分选，并将其接种至多聚-L-赖氨酸包被的培养板上，以促进细胞贴壁和增殖。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 用多聚-L-赖氨酸包被玻璃盖玻片

1. 取5 mL浓度为200 µg/mL的多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液，解冻后备用。将该原液加入45 mL室温的注射级纯水中，稀释至20 µg/mL。用滤器过滤除菌后转移至新的50 mL锥形管中，并标记为“PLL Sterile”。
   注意：使用室温存放的水可加快解冻过程。
2. 将100片无菌圆形玻璃盖玻片（直径12 mm）加入无菌PLL溶液中。每5–10分钟轻轻振荡管子2–3分钟，确保涂层均匀。持续孵育1小时完成包被。
   注意：推荐使用德国制造的圆形玻璃盖玻片（直径 = 12 mm），因其可提供可靠的细胞培养表面，并能轻松放入24孔细胞培养板的孔中。
3. PLL包被40分钟后，取两张纸巾平铺于超净工作台内，用70%乙醇灭菌，展平以去除褶皱，随后静置晾干。
4. 完成1小时PLL包被后，吸除多余的PLL溶液，加入无菌注射级水。轻轻振荡盖玻片2–3秒，以去除残留的PLL。重复此漂洗步骤2次。
5. 吸除多余水分后，将盖玻片转移至无菌纸巾上。使用弯头镊子小心分离每一片盖玻片，并静置干燥。
   注意：若盖玻片难以分离，可将其弃用；或加入少量水辅....

结果

图1：谷氨酸能神经元与GABA能神经元的分离纯化。（A）NexCre;Ai9小鼠中TdTomato转基因表达（上图）和VGAT Venus小鼠中Venus转基因表达（下图）所产生的荧光信号图像。比例尺 = 5 mm。（B）来自NexCre;Ai9小鼠（上图）和VGAT Venus小鼠（下图）的皮质-海马解离细胞中TdTomato与Venus荧光的强度散点图。选择具有强荧光信号的TdTomato或Venus阳性神经元进行分选（由门控框标示）。（C，左）分选后TdTomato阳性（上图）和Venus阳性（下图）神经元的共聚焦图像。（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
神经基础培养基（NBA）	ThermoFisher Scientific	10888022	细胞培养缓冲液
B27	ThermoFisher Scientific	17504001	培养补充剂
Glutamax	ThermoFisher Scientific	35050-038	培养补充剂
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	ThermoFisher Scientific	15140-122	抗生素
Poly-L-Lysine	SIGMA	P1399	盖玻片包被剂
木瓜蛋白酶（Papain）	SIGMA	P4762-1G	酶
牛血清白蛋白	SIGMA	A3294-100G	血清
低荧光Hibernate A培养基	Brain Bits Ltd	HALF	细胞转运培养基
细尖巴斯德吸管	Neo Labs	-	用于细胞吹打重悬
24孔板	BD	353047	培养板
50 mL Falcon管	BD	352070	-
15 mL Falcon管	BD	352096	-
玻璃盖玻片：12 mm圆形	Roth	P231.1	-
35 mm培养皿	Corning	353001	-
100 mm培养皿	Corning	353003	-
30 µm CellTrics细胞筛	sysmex	04-004-2326	细胞分选前去除细胞团块
圆底聚苯乙烯管	BD	352054	分选后细胞的转运管
圆底聚丙烯管	BD	352063	分选后细胞的收集管
超细Bonn剪刀	Fine Scientific Tools	14084-08	用于去除小鼠头部覆盖的皮肤和颅骨
超窄剪刀	Fine Scientific Tools	14088-10	用于去除大鼠头部覆盖的皮肤和颅骨
镊子	Fine Scientific Tools	11242-40	用于固定头部位置
刮勺（130 mm长 / 5 mm尖端宽度）	Fine Scientific Tools	3006.1	用于将脑组织转移至滤纸上
手术刀片	Swan-Morton	#0308	用于机械解离神经组织
血细胞计数板（Neubauer 改良型）	Optik Labor	-	用于计数解离后的细胞