在无血清单层培养中由胚胎干细胞生成神经前体细胞

摘要

来源：Wongpaiboonwattana, W.，等。小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养中的神经分化。J. Vis. Exp.(2015)

该视频展示了一种利用无血清培养基从小鼠胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的实验方案。将处于无血清培养基中的胚胎干细胞以适宜浓度接种于明胶包被的盖玻片上。在最佳细胞密度下，细胞会分泌自分泌信号因子，这些因子与无血清培养基中的神经分化诱导因子共同作用，触发胚胎干细胞向神经前体细胞分化。

方案

1. 培养基制备

注意：该方案依赖于使用两种不同培养基的混合物：添加了改良N2补充剂的DMEM/F12培养基，以及添加了B27补充剂的Neurobasal培养基，通常按1:1比例混合使用。

1. 通过在15 ml离心管中混合各组分来配制改良N2补充剂。切勿涡旋或过滤该溶液；通过反复倒置离心管直至溶液澄清来进行混匀。
   1. 首先用移液器加入7.2 ml DMEM/F12，然后加入1 ml浓度为25 mg/ml的胰岛素溶液（溶于0.01 M HCl中），通过反复倒置离心管充分混匀。溶液澄清约需几分钟时间。
   2. 加入1 ml浓度为100 mg/ml的apo-转铁蛋白溶液（溶于水中）、33 µl浓度为0.6 mg/ml的孕酮溶液（溶于乙醇中）、100 µl浓度为160 mg/ml（1 M）的腐胺溶液（溶于水中）、10 µl浓度为3 mM的亚硒酸钠溶液（溶于水中）以及666 µl浓度为7.5%的牛血清白蛋白溶液，并充分混匀。将溶液分装为每份2.5 ml，于-20 °C保存，可保存长达2个月。
2. 配制培养基。
   1. 向250 ml DMEM/F12培养基中加入2.5 ml N2补充剂。充分混匀，但不要振荡或过滤。
   2. 向250 ml Neurobasal培养基中加入5 ml B27补充剂。充分混匀，但不要振荡或过滤。
   3. 将步骤1.2.1和1.2.2中的培养基按1:1比例混合。在某些情况下可能需要1:3的比例（补充方式同步骤1.2.4中的1:1混合液）。
   4. 向混合液中加入0.5 ml L-谷氨酰胺（终浓度0.2 mM）和3.5 µl 2-巯基乙醇（终浓度0.1 mM），轻轻混匀，避免振荡。将培养基于4 °C保存，可保存长达3周，并避免光照。此最终混合液称为N2B27。
3. 配制明胶溶液。
   1. 用超纯水配制1%明胶溶液，并在121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟。用于配制的瓶子必须彻底清除洗涤剂或消毒剂残留，建议使用新瓶子，并且每次使用后仅用超纯水冲洗。将1%明胶溶液分装为每份50 ml，于4 °C保存，可保存数月。
   2. 将一份1%明胶溶液置于37 °C水浴中加热至完全溶解，然后加入500 ml预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中。充分混匀后，取适量溶液加入每个孔或培养板中，使其完全覆盖底部表面。让明胶在表面包被至少30分钟。

2. 细胞接种

注意：本方案同样适用于在以下培养基中培养的小鼠胚胎干细胞（ESC）：含10%胎牛血清及白血病抑制因子（LIF）的培养基、含血清替代物及LIF的培养基、或含LIF及骨形态发生蛋白4（BMP4）的无血清培养基，以及含MEK和GSK3抑制剂（2i培养基）有或无LIF的培养基。然而，分化的时间和效率可能因培养基和细胞类型的不同而有所差异。本实验中所展示的结果使用的是46C小鼠ESC系（其内源性Sox1等位基因之一敲入了EGFP报告基因），该细胞系在GMEM培养基中添加10%血清和LIF的条件下培养。为获得最佳结果，关键步骤是将细胞解离后重新接种至N2B27培养基中；若仅将培养基从GMEM/血清/LIF直接更换为N2B27，与重新接种细胞相比，总会导致分化效率降低。

1. 在GMEM培养基中培养细胞，添加10%血清、1 mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、0.1 M 2-巯基乙醇和100单位/毫升LIF13。为获得小鼠胚胎干细胞的亚融合培养物，接种1 × 10⁵细胞/10厘米培养皿⁶ 将细胞接种至T25培养瓶中，培养时间为2-3天。
2. 在明场显微镜下观察细胞。当细胞处于亚融合状态并准备传代时，用PBS洗涤细胞两次。加入1 ml细胞解离试剂，放回培养箱中孵育2–5分钟。尽管胰蛋白酶及其他酶也可用于细胞解离，但可能对细胞贴壁产生不利影响，因此需要调整接种密度。
3. 当细胞开始从培养板上脱落时，轻敲容器，使细胞分散成单细胞悬液。将细胞收集到含有10 ml培养基和细胞解离试剂的溶液中，并用移液器转移至15 ml离心管中。
4. 在室温下以 300 × g 离心 3 分钟。
5. 小心吸除上清液，将沉淀物用 10 ml 预热的 N2B27 培养基通过上下吹打 3–5 次重新悬浮。吹打时，将移液枪头紧贴离心管管壁缓慢释放液体，以避免产生气泡。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，并记录细胞浓度。
6. 在预热的 N2B27 培养基中制备细胞悬液，使其浓度达到每平方厘米接种 10,500 个细胞的密度² 在6孔板中（即1 x 10⁵ 每孔细胞数为6孔板的最佳接种量。参见 表1 建议的每平方厘米细胞数量² 以及各种细胞培养容器的铺板培养基体积。
7. 吸出培养容器中的明胶，并根据建议的密度和体积接种细胞悬液 表1. 不要晃动培养板，以免细胞聚集到中央。将培养物置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中₂.
8. 每1至2天更换一次培养基，用新鲜的N2B27完全替换原有培养基。吹打时动作需轻柔，以免冲走细胞，影响细胞密度，进而降低后续分化效率。若铺板后初始细胞存活率较低，可将细胞接种于N2与B27补充培养基按1:3比例混合的培养基中，并在前两天后更换为N2B27。细胞将开始分化，通常在4至6天内出现Sox1表达（通过本实验所用46C细胞系中报告基因的绿色荧光可见）。

表1. 不同培养容器规格建议的接种密度和培养基体积。 本表中的接种密度是使用46C细胞系确定的。为获得最佳结果，每种细胞系的接种密度可能需要单独调整。

培养板类型	有效细胞密度范围 (个细胞/cm2)	建议接种细胞数量范围	建议初始培养液体积 (µl)	第1天后建议培养液体积 (µl)
6孔板	10,500 - 36,500	99,750 - 346,750	1,000	2,000
24孔板	15,600 - 46,800	29,640 - 88,920	500	1,000
96孔板	103,500 - 260,000	33,120 - 83,200	100	200

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Life Technologies	A11105-01
B-27 添加剂，无血清	Life Technologies	17504-044
胰岛素	Sigma	I6634	用无菌的 0.01M HCl 重悬
去铁转铁蛋白	Sigma	T1147	用无菌水重悬
孕酮	Sigma	P8783	用乙醇重悬
腐胺	Sigma	P5780	用无菌水重悬
亚硒酸钠	Sigma	S5261	用无菌水重悬
牛血清白蛋白 V 组分	Life Technologies	15260-037
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081	使用前确保完全溶解，因为谷氨酰胺通常会沉淀
明胶	Sigma	G1890
6 孔组织培养皿	Thermo Scientific	140675
24 孔组织培养皿	Thermo Scientific	142475
96 孔组织培养皿	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
胎牛血清	Life Technologies	10270-106
MEM 非必需氨基酸溶液	Life Technologies	11140-050
丙酮酸钠	Life Technologies	11360-070
2-巯基乙醇	Sigma	M7522
25 cm² 组织培养瓶	Thermo Scientific	156367