利用多孔支架将人神经干细胞分化为三维培养

摘要

来源：Stevanato, L. 等，三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及其潜在靶基因分析。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了人类神经干细胞在三维支架内的发育与分化过程。支架表面的层粘连蛋白涂层可促进细胞黏附，而无生长因子的神经培养基则诱导细胞分化为神经前体细胞。这些细胞在多孔结构中向多个方向延伸其突起，形成三维培养体系。

方案

1. 三维（3D）培养中HNSC的分化

注意：从先前发表文章中描述的经伦理批准的组织中分离并获取人神经干细胞（hNSCs）。在进行本操作时，请遵循相应的伦理和机构指南。

1. 使用 12孔板进行3D培养
   1. 整个操作过程中均需采用无菌技术。在生物安全柜中，通过沿每孔孔壁加入2 ml/孔使用冲洗用水（WFIr）配制的70%乙醇来重新水化支架，避免直接接触支架。
   2. 小心吸除70%乙醇，并立即用2 ml/孔的DMEM/F12培养基（DMEM:F12）清洗支架1分钟。重复清洗步骤两次。最后一次清洗后，小心吸除DMEM:F12。
   3. 在DMEM:F12培养基中加入层粘连蛋白（10 µg/ml），每孔2 ml，覆盖支架。将培养板置于37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育至少2小时。用预热的DMEM:F12清洗培养板。
   4. 每块支架接种约500,000个hNSCs，接种体积为150 µl含生长因子的RMM培养基（RMM+GFs）。
   5. 将培养板置于37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育3小时，使细胞沉降并进入支架。
   6. 每孔加入3.5 ml RMM培养基，注意避免将细胞从支架上冲起。
   7. 继续孵育7天；在接种后第1天（首次换液）更换培养基（3.5 ml/孔），并在首次换液后2-3天再次更换。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM:F12	Invitrogen	21331-020	用于 RMM 培养基的配制
人白蛋白溶液	Baxter health care limited	1501052	RMM 培养基中使用，终浓度为 0.03%
转铁蛋白，人重组	Sigma	T8158	RMM 培养基中使用，终浓度为 5 µg/ml
亚精胺二盐酸盐	Sigma	P5780	RMM 培养基中使用，终浓度为 16.2 µg/ml
胰岛素，人重组	Sigma	I9278	RMM 培养基中使用，终浓度为 5 µg/ml
孕酮	Sigma	P6149	RMM 培养基中使用，终浓度为 60 ng/ml
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-24	RMM 培养基中使用，终浓度为 2 mM
亚硒酸钠	Sigma	S9133	RMM 培养基中使用，终浓度为 40 ng/ml
bFGF	Peprotech	AF-100-15	需添加至 RMM 培养基，终浓度为 10 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-188	需添加至 RMM 培养基，终浓度为 20 ng/ml
4-OHT	Sigma	H7904	需添加至 RMM 培养基，终浓度为 100 nM
层粘连蛋白	AMS Biotech	3400-010-10
冲洗用水	Baxter Healthcare	UKF7114
Alvetex 12 孔板	Reinnervate Ltd	AVP002
乙醇	Merck	1.00986.1000