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1. 培养皿包被、培养基制备和人多能干细胞维持的准备工作
- 培养皿包被
- 玻璃粘连蛋白（VTN）包被
- 将VTN小瓶置于37 °C水浴中直至完全解冻，然后充分混匀。
- 对于100 mm培养皿，将7 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）与0.5 mg/mL VTN混合，加入VTN溶液至培养皿中，在室温（RT）下孵育1小时。
- 基底膜基质包被
- 将基底膜基质小瓶（见材料表）在4 °C冰上过夜解冻。
- 对于6孔板中的一个孔，将2 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）与20 µL 100×基底膜基质混合，加入基底膜基质溶液至培养皿中，用封口膜包裹培养皿，并在4 °C洁净容器中过夜储存。操作应尽可能迅速。包被后的培养皿可在4 °C保存最多2周。
- 多聚鸟氨酸（PO）/层粘连蛋白（LM）/纤连蛋白（FN）包被
- 第一天，对于24孔板中的一个孔，将15 µg/mL PO与1 mL 1×PBS混合，在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。将LM和FN均在-20 °C过夜解冻，完全解冻后转移至4 °C保存。
- 第二天，吸除PO溶液，用1×PBS洗涤孔内2次，加入含2 µg/mL LM和2 µg/mL FN的1 mL 1×PBS，于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。此时，含LM/FN溶液的培养皿只要不干燥，可在培养箱中保存数月。为防止干燥，可补充更多1×PBS。
- 培养基制备
- 制备Essential 8培养基（E8）：将一瓶E8添加剂在4 °C过夜解冻，将添加剂与500 mL E8基础培养基混合，根据需要加入抗生素。
注意：配制好的E8工作液应在2周内用完。
- 制备hPSC冻存培养基：将90 mL完全E8培养基与10 mL二甲基亚砜（DMSO）混合，总体积为100 mL。过滤除菌。
- 制备第0天至第1天分化培养基：将100 mL Essential 6（E6）培养基与10 µM SB431542、1 ng/mL骨形态发生蛋白4（BMP4）、300 nM CHIR99021和10 µM Y27632混合，总体积为100 mL。
- 制备第2天至第10天分化培养基：将100 mL E6培养基与10 µM SB和0.75 µM CHIR99021混合，总体积为100 mL。
- 制备第10天至第14天类球体培养基：将神经基础培养基与2 mL B27（50×）、1 mL N2（100×）、2 mM L-谷氨酸、3 µM CHIR99021和10 ng/mL成纤维细胞生长因子-2（FGF2）混合，总体积为100 mL。
- 制备第14天至第28天类球体长期维持培养基：每次换液时，在第10天至第14天类球体培养基中添加0.5 µM新鲜的维甲酸（RA）。
注意：RA应始终保存在-80 °C。
- 制备SymN成熟培养基：将神经基础培养基与2 mL B27（50×）、1 mL N2（100×）、2 mM L-谷氨酸、25 ng/mL胶质细胞系来源神经营养因子（GDNF）、25 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、25 ng/mL神经生长因子（NGF）、200 µM抗坏血酸和0.2 mM二丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）混合，总体积为100 mL。该溶液应在2周内使用完毕。每次换液前添加0.125 µM新鲜RA。该溶液从第14天（方案1）或第28天（方案2）开始使用。
- 制备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：将DMEM与2%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酸及根据需要添加的抗生素混合，总体积为100 mL。
- hPSC的维持
- hPSC的解冻与培养
- 准备一个VTN包被的100 mm培养皿。
- 直接从液氮中取出hPSC冻存管，将其放入37 °C水浴中，轻轻晃动冻存管直至完全解冻。将解冻后的hPSC转移至含10 mL 1×PBS的15 mL离心管中，以200 × g离心4分钟。
- 弃去上清液，向管中加入1 mL E8培养基，吹打数次使细胞沉淀充分重悬，再加入9 mL E8培养基，总体积为10 mL。
- 吸除100 mm培养皿中的VTN溶液。
- 将hPSC转移至100 mm培养皿中，轻轻摇晃（上下左右，非环形）以确保细胞在培养皿中均匀分布。
- 在37 °C、5% CO2条件下孵育。
- 次日，吸除全部培养基，加入10 mL E8培养基进行换液。
- 此后每日换液，持续3–4天，然后准备传代。
- hPSC传代
注意：传代时hPSC应达到80%–90%汇合度。应观察到大而完整、边缘光滑明亮的克隆。但应避免克隆之间相互接触（图1B，第0天和图4B）。
- 根据需要准备VTN包被的100 mm培养皿。
- 吸除E8培养基，用1×PBS洗涤待传代的培养皿1次。
- 吸除1×PBS，加入4 mL 0.25 M EDTA，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。
注意：hPSC应以小克隆形式进行传代/重铺。EDTA处理时间不应超过2分钟，以防止细胞解离为单细胞。2分钟处理后，细胞仍应附着在培养皿表面。
- 吸除EDTA，用10 mL E8培养基强力吹打培养皿表面以解离克隆，并将所有培养基和细胞收集至15 mL离心管中。
- 当hPSC汇合度为80%–90%时，按1:15–1:20比例传代。例如，若按1:20比例将hPSC传代至一个100 mm培养皿，取500 µL E8/hPSC混合液，与9.5 mL新鲜E8培养基混合。
- 将hPSC接种至VTN包被的100 mm培养皿中。
注意：建议每位研究人员根据自身实验条件和细胞系独立确定最佳传代比例。
- hPSC冻存
- 对于一个即将传代的100 mm培养皿中的hPSC，准备三个冻存管和3.5 mL冻存培养基。
注意：培养基和冻存管应在使用前保持在4 °C或冰上。
- 吸除E8培养基，用1×PBS洗涤培养皿2次。
- 吸除1×PBS，加入4 mL 0.25 M EDTA，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。
注意：hPSC应在准备传代时以小克隆形式冻存。EDTA处理时间不应超过2分钟，以防止细胞解离为单细胞。2分钟处理后，细胞仍应附着在培养皿表面。
- 吸除EDTA，用10 mL 1×PBS强力吹打培养皿表面以解离克隆，并将所有培养基和细胞收集至50 mL离心管中。
- 加入20 mL 1×PBS，以200 × g离心4分钟，以洗去残留EDTA。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于3 mL冻存培养基中。
- 将hPSC均匀分装至三个冻存管中，每管1 mL。
- 在-80 °C过夜保存于程序降温盒或泡沫板夹层中，以确保缓慢降温，随后转移至液氮罐中长期保存。
2. 接种hPSCs以启动分化（第0天）
注意：人多能干细胞（hPSCs）应在复苏后经过稳定培养（即解冻后传代2–3次）并处于适合分化的状态。确保细胞集落生长状态良好，边缘光滑发亮，且分化程度最低（图2B）。
- 根据需要，在第0天前一天准备包被基底膜基质的培养皿（24孔或6孔培养皿），并在开始分化时将培养皿恢复至室温。
- 根据需要配制第0–1天分化培养基。
- 吸除汇合且准备传代的hPSCs中的E8培养基，用1×PBS洗涤培养皿2次。
- 每100 mm培养皿加入7 mL 0.25 M EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。
注意： 此时延长EDTA处理时间以使细胞分散为单细胞。
- 用移液器将所有hPSCs（应呈悬浮状态）转移至50 mL离心管中。加入与EDTA溶液体积相等或更多的1×PBS以稀释EDTA。
- 以200 × g离心4分钟。
- 弃去上清液，加入1 mL第0–1天分化培养基，吹打混匀细胞。随后加入更多培养基混匀，将细胞悬液稀释至适合细胞计数的浓度。
注意： 不要过度稀释细胞悬液。一个完整100 mm培养皿的细胞应起始于5 mL培养基中。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
- 根据需要将细胞悬液稀释至终浓度为125,000个细胞/cm2，并保持较低的终体积（例如，6孔板每孔2 mL，24孔板每孔500 µL）。
注意： 较低体积有助于细胞更快贴附。
- 吸除包被培养皿中的所有基底膜基质溶液，将细胞悬液接种至各孔中。
- 于37 °C、5% CO2条件下孵育。
3. 神经嵴细胞诱导（第1天至第10天，图1A）
- 第1天，使用第0–1天分化培养基对细胞进行换液（6孔板每孔3 mL，24孔板每孔1 mL）。
- 第2天，使用第2–10天分化培养基对细胞进行换液（6孔板每孔3 mL，24孔板每孔1 mL）。
- 此后，应每隔一天换液一次，直至第10天（即下一次换液时间为第4天）。
注意：从第6天开始，应可观察到神经嵴（NC）脊的形成（图1B）。为确认分化是否正常进行，建议在较小孔板（如24孔板）中平行培养一组细胞，用于在分化过程中不同时间点进行SOX10/AP2a免疫染色及标志基因表达分析（图1B、图1C）。
- 若需进行细胞分选，请进入第4节；否则，请进入第5节。
4. 采用荧光激活细胞分选（FACS）检测神经嵴标志物CD49D及在类球体中聚集的神经嵴细胞
注意：进行流式细胞分选（FACS）时，样本在染色后直至分选完成前应始终保持在冰上，并避免暴露于光线下。
- 如果需要分选细胞，请准备FACS缓冲液。
- 制备第10–14天的球状体培养基。
- 第10天，移除培养基，用1×PBS洗涤1次。
- 加入解离溶液（参见 材料表) 每孔加入2 mL（6孔板）或每孔1 mL（24孔板），于37 °C、5% CO₂条件下培养2 20 分钟。
- 用移液器吸除所有hPSCs，并转移至50 mL离心管中。
- 用 FACS 缓冲液补满离心管，200 x g 离心 g 4 分钟。
注意： 每个50 mL离心管最多可容纳不超过20 mL的细胞悬液。FACS缓冲液的体积应足够以中和解离溶液。
- 弃去上清液，用适量FACS缓冲液重悬细胞（6孔板每孔约2 mL），计数以确定细胞数量。
- 制备以下样品。
- 样本1（未染色对照）：1 × 106 在400 µL FACS缓冲液中重悬细胞，通过20 µm滤膜管盖过滤，将离心管置于冰上保存。
- 样本2（仅DAPI对照）：1 × 106 在含有0.5 µg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的400 µL FACS缓冲液中重悬细胞。通过带滤网帽的FACS管过滤细胞，并将试管置于冰上保存。
- 样本3（CD49D标记）：将剩余细胞重悬于含藻红蛋白/氰基7（PE/Cy7）标记的CD49D抗体的FACS缓冲液中（每100 µL FACS缓冲液加入5 µL抗体，用于1 × 10⁶个细胞），置于15 mL离心管中，冰上孵育20分钟。
- 用 FACS 缓冲液补满离心管，在 200 x g 条件下离心 g 4 分钟。
- 弃去上清液，重悬每 5–10 x 106 根据制造商说明书，将细胞重悬于含0.5 μg/mL DAPI的1 mL FACS缓冲液中。
- 通过带有滤网帽的FACS管过滤细胞，并将试管置于冰上。
- 准备含有2 mL FACS缓冲液的收集FACS管。
- 使用能够检测DAPI和PE-Cy7的流式细胞分选仪（FACS）分选CD49D阳性细胞+ 群体
- 分选后，对分选的细胞进行计数。
- 将所有分选后的细胞离心，并重悬于第10–14天类球体培养基中，最终浓度为0.5 × 106 每 500 µL 培养基中的细胞数。
- 接种 0.5 × 106 每孔细胞接种于超低吸附24孔板中。
- 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2.
5. 将神经嵴细胞在球状体中聚集成团
- 若不使用流式细胞术分离神经嵴细胞，而是直接将其聚集成球状体，则首先按照步骤 4.2–4.5 所述方法制备细胞。
- 用 1× PBS 补充至管中其余体积，并在 200 × g 条件下离心 4 分钟。
- 弃去上清液，用适量第 10–14 天球状体培养基重悬细胞（例如，每孔约 2 mL 培养基用于 6 孔板），并进行细胞计数以确定细胞数量。
- 用第 10–14 天球状体培养基将细胞稀释至每 500 µL 培养基中含有 0.5 × 106 个细胞。
- 将 500 µL 细胞悬液接种至超低吸附 24 孔板的每孔中。
- 将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
6. 神经嵴类球体的维持与交感神经前体诱导（第10天至第14天，图3A）
- 方案1：最小化类球体培养
- 第11天，在未吸除第10天培养基的情况下，向NC类球体中加入500 µL第10–14天类球体培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育。
- 第12天，倾斜培养板使NC类球体聚集于孔的一侧。小心吸除尽可能多的培养基并弃去，然后加入1 mL第10–14天类球体培养基进行换液。
- 持续每天换液，直至第14天。
- 可选步骤：若类球体发生聚集形成大团块，可用移液器将类球体团块打散。此操作还可防止单个类球体过大。
注意：理想的类球体大小范围约为100–500 μm。在此范围内，单个类球体的具体尺寸并不关键。然而，形态特征（如边缘光滑清晰）对于后续实验的成功至关重要（图2和图4）。在第14天时，每个24孔板理想情况下应含有约50–60个处于上述尺寸范围内的不同大小的类球体。
- 方案2：扩增类球体培养
- 第15天，为维持NC类球体生长，加入含0.5 µM RA的1.5 mL第10–14天类球体培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育。
注意：RA需每次换液时新鲜添加，并始终保存于-80 °C。
- 此后每隔一天换液一次，持续至第28天，然后继续进行类球体铺板操作（第7.1节）。
注意：生长中的类球体大约每周通过1 mL移液器吹打分散一次，分裂比例约为1:2–1:4。在为期两周的扩增期间，细胞数量应大致扩增至原来的四倍。
7. 交感神经元（SymN）分化与成熟（选项1：第14天后；选项2：第28天后）
- 在普通培养皿中接种类球体
- 准备经PO/LM/FM包被的24孔板。
- 配制含有0.125 µM RA（每次换液时新鲜添加）和10 µM Y27632（仅第14天使用）的symN培养基。
- 第14天，倾斜培养板使神经嵴类球体聚集于孔的一侧，小心吸除并弃去尽可能多的培养基，然后加入1 mL symN培养基。
- 从包被好的培养板中去除LM/FN。
- 将原24孔板中每孔的内容物分种到新的包被24孔板中的4个独立孔中。每个原始孔含有约50–60个类球体，总体积为1 mL。因此，新板中每孔将获得250 µL培养基，含大约10–15个类球体。
- 每孔额外添加250 µL培养基。
注意：此为1:4比例的传代；确保类球体在溶液中分布均匀，以实现相对均一的分种。无需精确计数类球体数量，因为最终数量不影响symN生成的成功率。
- 在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 第15天（或方案2中的第29天），更换全部培养基为1 mL含0.125 µM RA的symN培养基。此后，神经元应每隔2天换液一次，直至第20天（或方案2中的第35天）。
- 第20天之后（或方案2中的第35天之后），应仅更换一半原有培养基（500 µL）。此后每周换液一次，除非培养基迅速变黄。
- 持续每周换液至所需时间点。
注意：symN倾向于聚集成类似神经节的结构，并容易从培养皿上脱落。为防止此现象，建议采用半量换液并尽量减少操作。
