来源：Wu, H. F.，等。在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元。J. Vis. Exp. (2020)。
本视频演示了一种 体外 从人多能干细胞（hPSCs）生成节后交感神经元的方法。hPSCs在基底膜基质上使用分化培养基诱导分化为神经嵴细胞（NCCs）。随后将NCCs解离，并在另一种分化培养基中形成球状体。最后，利用交感神经元培养基将球状体转化为节后交感神经元。
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方法文章
由人多能干细胞生成节后交感神经元
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 培养皿包被、培养基制备和人多能干细胞维持的准备工作
- 培养皿包被
- 玻璃粘连蛋白（VTN）包被
- 将VTN小瓶置于37 °C水浴中直至完全解冻，然后充分混匀。
- 对于100 mm培养皿，将7 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）与0.5 mg/mL VTN混合，加入VTN溶液至培养皿中，在室温（RT）下孵育1小时。
- 基底膜基质包被
- 将基底膜基质小瓶（见材料表）在4 °C冰上过夜解冻。
- 对于6孔板中的一个孔，将2 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）与20 µL 100×基底膜基质混合，加入基底膜基质溶液至培养皿中，用封口膜包裹培养皿，并在4 °C洁净容器中过夜储存。操作应尽可能迅速。包被后的培养皿可在4 °C保存最多2周。
- 多聚鸟氨酸（PO）/层粘连蛋白（LM）/纤连蛋白（FN）包被
- 第一天，对于24孔板中的一个孔，将15 µg/mL PO与1 mL 1×PBS混合，在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。将LM和FN....
- 玻璃粘连蛋白（VTN）包被
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结果
图1：神经嵴（NC）诱导。（A）从第0天到第10天神经嵴诱导的时间线及处理方式。（B）通过明场显微镜每2天监测一次神经嵴脊的形态与形成情况。自第2天起各时间点的细胞均进行AP2A（红色）与SOX10（绿色）共染色。所有免疫荧光图像均用DAPI复染。红色箭头指示脊状结构。（C）第2至10天神经嵴标志物表达谱的qRT-PCR分析。（D）第10天CD49D+ 神经嵴细胞群的流式细胞分选代表性图谱（左）。前四幅图显示典型的设门策略及同型对照。同时对第10天CD49D+ 细胞百分比进行定量分析.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 细胞培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 15 mL 锥形细胞培养管 | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24 孔细胞培养板 | Falcon | 353047 | |
| 24 孔超低吸附培养板 | Corning | 07 200 601 和 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 细胞培养孵育箱 | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml 锥形细胞培养管 | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6 孔细胞培养板 | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | 细胞解离溶液 |
| 抗 AP2a 抗体 | Abcam | ab108311 | 宿主：兔；稀释比例：1:400 |
| 抗 Ascl1 抗体 | BD Pharmingen | 556604 | 宿主：小鼠 IgG1；稀释比例：1:200 |
| 抗 CD49D 抗体 | BioLegend | 304313 | 宿主：小鼠 IgG1；100 μl 体积中每百万细胞使用 5 μl |
| 抗 CD49D 抗体（同型对照） | BioLegend | 400125 | 宿主：小鼠 IgG1；100 μl 体积中每百万细胞使用 5 μl |
| 抗 DAPI 抗体 | Sigma | D9542 | 稀释比例：1:1000 |
| 抗 DBH 抗体 | Immunostar | 22806 | 宿主：兔；稀释比例：1:500 |
| 抗 GFP 抗体 | Abcam | ab13970 | 宿主：鸡；稀释比例：1:1000 |
| 抗 HOXC9 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | 宿主：小鼠 IgG1；稀释比例：1:100 |
| 抗 NET1 抗体 | Mab | NET17-1 | 宿主：小鼠；稀释比例：1:1000 |
| 抗 PRPH 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | 宿主：小鼠 IgG2a；稀释比例：1:200 |
| 抗 SOX10 抗体 | Abcam | ab50839 | 宿主：小鼠；稀释比例：1:100 |
| 抗 TH 抗体 | Pel-Freez | P40101- 150 | 宿主：兔；稀释比例：1:500 |
| 抗坏血酸 | Sigma | A8960-5G | 储存浓度：100 mM |
| B27 添加剂 | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | 储存浓度：50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | 储存浓度：10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | 储存浓度：6 mM |
| 细胞计数仪 | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| 细胞计数板载玻片 | Invitrogen | C10312 | |
| 离心机 | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | 储存浓度：6 mM |
| 冻存管 | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | 储存浓度：100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | 储存浓度：1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | 储存浓度：1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 培养基 | gibco | A15165-01 | |
| E8 培养基 | gibco | A15169-01 | 储存浓度：1x |
| E8 添加剂 | gibco | A15171-01 | 储存浓度：50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | 储存浓度：0.5 M |
| FACS 仪器 | Beckman Coulter | CytoFLEX（用于 FACS） | |
| FACS 仪器 | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ（用于分选） | |
| FACS 管（蓝色滤帽） | Falcon | 352235 | |
| FACS 管（白色盖） | Falcon | 352063 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | 储存浓度：10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | 基底膜基质；储存浓度：100x |
| 人多能干细胞（hPSCs） | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| 人多能干细胞（hPSCs） | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| 人纤连蛋白（FN） | VWR/Corning | 47743-654 | 储存浓度：1 mg/mL |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | 储存浓度：200 mM |
| 液氮罐（LN tank） | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| 小鼠层粘连蛋白 I（LM） | R&D Systems | 3400-010-01 | 储存浓度：1 mg/mL |
| N2 添加剂 | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | 储存浓度：100x |
| Neurobasal 培养基 | gibco | 21103-049 | 储存浓度：1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | 储存浓度：25 μg/mL |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190-136 | 储存浓度：1x |
| 聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐（PO） | Sigma | P3655 | 储存浓度：15 mg/mL |
| Primocin（抗生素） | InvivoGen | ANTPM1 | 储存浓度：50 mg/mL |
| qPCR 仪器 | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR 板 | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| 重组 FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | 储存浓度：10 μg/mL |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | 储存浓度：1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | 储存浓度：10 mM |
| 台盼蓝 | Corning | MT-25-900-CI | |
| 玻连蛋白（VTN） | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | 储存浓度：0.5 mg/mL |
| 水浴锅 | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | 储存浓度：10 mM |
