从人多能干细胞产生节后交感神经神经元

Abstract

来源:Wu， H. F.， et al. 在无饲养层和化学定义的培养条件下使用人类多能干细胞对节后交感神经元进行有效分化。J. Vis. Exp. （2020 年）。

该视频演示了一种从人多能干细胞 （hPSC） 生成节后交感神经神经元的体外方法。hPSC 使用分化培养基在基底膜基质载体上分化为神经嵴细胞 （NCC）。然后使用另一种分化培养基将 NCC 解离并形成球状体。最后，使用交感神经元介质将球体转化为节后交感神经元。

Protocol

1. 培养皿包被、培养基制备和 hPSC 维护的设置

1. 培养皿涂层
   1. 玻连蛋白 （VTN） 涂层
      1. 将小瓶 VTN 置于 37 °C 水浴中直至完全解冻，然后充分混合。
      2. 对于 100 mm 培养皿，将 7 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 与 0.5 mg/mL VTN 混合，将 VTN 溶液加入培养皿中，并在室温 （RT） 下孵育 1 小时。
   2. 基底膜基质涂层
      1. 将小瓶基底膜基质（参见材料表）在4°C的冰上解冻过夜。
      2. 对于 6 孔板的一个孔，将 2 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 与 20 μL 100x 基底膜基质混合，将基底膜基质溶液添加到培养皿中，用石蜡膜包裹培养皿，并在 4 °C 的干净容器中储存过夜。尽快工作。涂层培养皿可在 4 °C 下储存长达 2 周。
   3. 聚鸟氨酸 （PO）/层粘连蛋白 （LM）/纤连蛋白 （FN） 涂层
      1. 第一天，对于 24 孔板的一个孔，将 15 μg/mL 的 PO 与 1 mL 的 1x....

Results

图 1:NC 感应。 （A） 从第 0 天到第 10 天的 NC 诱导的时间表和治疗。（B） 明场显微镜每 2 天监测一次 NC 脊的形态和形成。对第 2 天后每个时间点的细胞进行 AP2A（红色）和 SOX10（绿色）共染色。所有免疫荧光图片均用 DAPI 复染。红色箭头表示山脊的结构。（C） 第 2-10 天 NC 标志物表达谱的 qRT-PCR 分析。（D） CD49D ⁺ NC 群体第 10 天 FACS 分选的代表性图（左）。典型的设门策略和同种型对照在前四个图中表示。还在第 10 天对 CD49D ⁺ 细胞百分比进行定量。（E） 第 2-10 天 HOX 基因表达谱的 qRT-PCR.......

Materials