斑马鱼神经干细胞原代神经球的生成与分化

摘要

来源：Lopez-Ramirez, M. A. 等，成年斑马鱼脑源性神经球的分离与培养。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了初级神经球的生成与分化过程。在生长因子存在条件下，斑马鱼的神经干细胞增殖形成具有自我更新能力的悬浮神经球，随后这些神经球可分化为胶质细胞和神经元。

方案

1. 准备工作

1. 准备 10 ml 解离培养基，将 200 µl 的 100 倍青霉素-链霉素溶液加入 9.8 ml 的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F12（DMEM/F12）中。
2. 制备 L-半胱氨酸溶液：向 10 ml 组织培养用水中加入 120 mg L-半胱氨酸。L-半胱氨酸溶液可在 4 °C 下保存最多 2 周，或分装后于 -20 °C 保存最多 1 年。
3. 制备 DNase I 溶液：向 1 ml 组织培养用水中加入 10 mg DNase I。DNase I 溶液可在 4 °C 下保存最多 2 个月。
4. 制备木瓜蛋白酶溶液：在 5 ml DMEM/F12 中加入 100 µl 木瓜蛋白酶（约 140 单位）、100 µl DNase I（1%）和 200 µl L-半胱氨酸（12 mg/ml）以制备木瓜蛋白酶溶液。每次使用前需新鲜配制，并在使用前用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。
5. 制备洗涤液：在 93.85 ml 的 1 倍杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）中加入 650 µl 45% 葡萄糖、500 µl 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，1 M）和 5 ml 胎牛血清（FBS），配制成 100 ml 洗涤液。使用前用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。洗涤液可在 4 °C 下保存最多 2 个月。
6. 制备胰岛素溶液：在 2 ml 组织培养用水中加入 25 µl 的 10 N 氢氧化钠（NaOH）和 100 mg 胰岛素，配制成 2 ml 胰岛素溶液。
7. 制备表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）溶液：将两种有丝分裂原分别溶解于 DMEM/F12 中，浓度为 100 µg/ml。分装为 10 µl 每份，于 -20 °C 保存。
8. 制备 B-27 和 N-2 培养基添加剂：将 B-27 和 N-2 补充剂分别分装为 500 µl 和 1 ml，于 -20 °C 保存。
9. 制备 Z-分化条件培养基：在 97.81 ml 的 DMEM/F12 中加入 40 µl 胰岛素（50 mg/ml）、500 µl B-27、1 ml N-2、650 µl 45% 葡萄糖和 1 ml 100 倍青霉素-链霉素，配制成 100 ml 的 Z-分化条件培养基。使用前用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。Z-分化条件培养基可在 4 °C 下保存最多 1 周。
10. 制备 Z-条件培养基：在 50 ml 无菌的 Z-分化条件培养基（含 20 ng/ml）中加入 10 µl EGF 和 10 µl FGF，配制成 50 ml 的 Z-条件培养基。Z-条件培养基可在 4 °C 下保存最多 1 周。
11. 制备用于分化培养的包被溶液：在 4.9 ml 的 DMEM/F12 中加入 100 µl 细胞外基质溶液（e.g., Matrigel），配制成 5 ml 的细胞外基质包被溶液。在冰上 4 °C 下解冻细胞外基质溶液。解冻后可在 4 °C 下保存最多 2 周。

2. 成年斑马鱼脑的解剖

1. 通过在直径100 mm、高15 mm的培养皿中填充凝胶冰袋来制备解剖台。然后将培养皿盖盖上，并在-20 °C下孵育直至凝胶完全冻结。在培养皿盖上方放置一张洁净的滤纸，并用塑料薄膜包裹滤纸和培养皿整体。
2. 每次使用前，用70%乙醇或加热方法清洁并灭菌所有显微解剖器械。将所有已灭菌的解剖器械放置在解剖显微镜附近，并在实施安乐死后立即将解剖台置于带光纤照明的显微镜下。
3. 准备2条成年斑马鱼用于全脑神经球的制备；准备3至4条斑马鱼用于从分离的脑区生成神经球。
4. 采用机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案对成年斑马鱼（8–12月龄）实施安乐死。随后将鱼浸入75%乙醇中5–10秒，迅速转移至解剖台上，并使用手术刀在鳃部水平进行断头。
   1. 为实施安乐死，给予三卡因甲烷磺酸盐过量剂量（300 mg/L），直至动物心跳逐渐减缓并停止循环，随后将其浸入冰水中。
5. 将头部背侧朝下，使用剪刀从切口侧向口部方向做一纵向切口。用镊子暴露颅骨基底，并移除所有邻近组织。从脊髓起始处沿颅骨侧壁向视顶区方向剪开。
6. 使用剪刀剪断并移除视神经，然后在视顶区水平移除颅骨最外侧两侧部分。将头部翻转为腹侧向上。用镊子剥离颅骨最顶端剩余部分。
7. 将脑组织连同颅骨残余部分转移至含有解剖介质（1.1）的新培养皿中。使用解剖刀的塑料手柄在解剖介质中清洗脑组织，保持所有脑结构完整无损。
8. 自此步骤起，继续使用整条斑马鱼脑组织进行本实验方案。
   1. 也可根据需要调整本方案，针对特定脑区进行操作，以从整脑或经新鲜解剖刀分离的端脑、视顶区/间脑或小脑中生成神经球。使用神经特异性荧光转基因斑马鱼品系，依据图1所示方法分离目标脑区。

3. 成年大脑单细胞分离

1. 所有后续操作均须在生物安全柜中进行。将脑组织转移至含有 800 µl 解剖液（步骤 1.1 中配制）的 1.5 ml 离心管中。用移液器吸除解剖液，注意不要触碰脑组织。
2. 加入 500 µl 木瓜蛋白酶溶液（步骤 1.4），于 37 °C 消化脑组织 10 分钟。孵育时间不得超过 15 分钟，以免降低细胞活力。
3. 孵育结束后，使用底部距尖端约 0.25 英寸处剪去的 1,000 µl 移液枪头，将脑组织连同 500 µl 木瓜蛋白酶溶液转移至 15 ml 圆锥形离心管中。用同一枪头缓慢吹打 10 次，轻柔地解离脑组织。吹打次数不得超过 15 次，且此过程中不得产生气泡，以免影响细胞活力。
4. 再次于 37 °C 孵育 10 分钟，随后使用未剪切的 1,000 µl 普通枪头吹打 10–13 次。吹打次数不得超过 15 次，以避免细胞死亡。
5. 加入 2 ml 洗涤液（步骤 1.5）以终止酶消化反应，然后将细胞悬液在室温（RT）下以 800 × g 离心 5 分钟。小心倾去上清液，通过用力弹击管壁使沉淀重悬于残留液体中，再用 1,000 µl 普通枪头吹打数次。随后，加入 2 ml 洗涤液。
6. 此时应在显微镜下检查是否已获得单细胞悬液。再次将细胞悬液在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 ml 新鲜 Z-条件培养基（步骤 1.10）重悬沉淀。
7. 使用台盼蓝染色细胞，通过血细胞计数板计数活细胞（排除染成蓝色的死细胞）。在 24 孔板中每孔加入 200 µl 细胞悬液和 300 µl 新鲜 Z-条件培养基。接种细胞密度约为 500 个细胞/µl。将培养的细胞置于 30 °C、5% CO₂ 的培养箱中维持培养，因为斑马鱼脑源性神经球在 37 °C 下生长不佳。

4. 原代神经球的生成

1. 1 天后 体外 （DiV1），在显微镜下观察从成年全脑获得的单细胞悬液，注意观察孔中是否有碎片聚集在中央。用移液器小心吸除约100 µl培养基（尽可能少），以去除任何碎片。随后加入100 µl新鲜Z-条件培养基。此时应观察单细胞悬液（图2A DiV1).
2. 2 天后 体外 （第2天），扩增培养的细胞。使用剪去尖端的1,000 µl移液枪，从每个孔中吸取250 µl细胞悬液并转移至新孔中。向所有孔中加入250 µl新鲜的Z条件培养基。在扩增培养细胞前，通过上下轻柔吹打整个孔内的液体，非常轻柔地混匀细胞悬液。
3. 在接下来的4天内重复步骤4.1和4.2 体外 (DiV4)。在DiV3和DiV4时，应可见培养孔中心及边缘处神经球的体积逐渐增大。图2B 和 C).
   注意： 原代神经球可用于传代或诱导分化以评估其多向分化潜能。此外，也可对其进行核转染或脂质体转染，以研究特定基因在分化过程中的作用。

5. 原代神经球的传代

1. 从每个孔中移除 250 μl 组织培养液，并用 1 ml 移液器机械解离 DiV4 神经球。移液时不要过快地上下吹打，以免产生气泡而增加细胞死亡。
2. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将800个细胞/µl接种于24孔板的每孔中，每孔体积为250 µl的原代培养上清液。
3. 向每个孔中加入 250 µl Z-条件培养基。
4. 2 天后 体外 (DiV2)，按照步骤4.2和4.3所述方法扩增培养的细胞。

6. 原代神经球的分化

1. 将盖玻片浸入70%乙醇中10分钟进行灭菌，然后在室温下将盖玻片放入12孔板的各孔中晾干。
2. 在盖玻片中央加入300 µl细胞外基质包被液（步骤1.11），使液体充分展开并覆盖整个盖玻片表面，随后在37 °C恒温培养箱（加湿）中孵育1小时。
3. 孵育结束后移除细胞外基质包被液，并在37 °C下将盖玻片干燥2小时。
4. 从每孔中移除250 µl组织培养液。使用1 ml移液器（带宽口吸头）反复吹打，将每孔中的DiV4原代神经球进行机械性解离。
5. 将解离后的神经球细胞悬液以4 × 10³ 细胞/ml的密度接种到预先制备好的细胞外基质包被的盖玻片上（步骤6.1–6.3），在30 °C、5% CO₂条件下孵育至少30分钟，直至细胞贴附于基质表面。随后移除培养基，并迅速加入1 ml预热的新鲜Z-分化条件培养基（步骤1.9），在30 °C、5% CO₂条件下继续培养24小时。
6. 在细胞分化期间，每隔两天更换一半的Z-分化条件培养基。

结果

图1：斑马鱼脑源性神经球的分化。（A–C、E）在Z-分化培养基中培养1天（A，DiVd1）、3天（B，DiVd3）和4天（C 和 D，DiVd4）的全脑源性神经球的相差显微图像。（E）12月龄Tg(GFAP:DsRed)斑马鱼全脑的背侧视图。如图所示，分离并收集端脑（Tel）、视顶盖（Tec）和小脑（Cer）。（D）来自视顶盖、端脑和小脑的DiVd...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPBS 1X	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1X	Life Technologies	11330-032
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 补充剂（100倍液）
HEPES	Life Technologies	15630	1M
D-(+)-葡萄糖 45%	Sigma	G8769
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
胎牛血清	Life Technologies	16000044
人碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
人表皮生长因子	Peprotech	AF-100-15
胰岛素	Sigma	I5500-50 mg
脱氧核糖核酸酶	Sigma	DN25-10mg
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
多聚甲醛	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
三卡因 MS-222	Sigma	A5040	4 mg/ml 储存液
Trycold 凝胶	Sigma	TGP8	凝胶包
台盼蓝染液	Life Technologies	15250061