斑马鱼神经干细胞原代神经球的生成与分化

摘要

来源：Lopez-Ramirez, M. A. 等，成年斑马鱼脑源性神经球的分离与培养。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了初级神经球的生成与分化过程。在生长因子存在条件下，斑马鱼的神经干细胞增殖形成具有自我更新能力的悬浮神经球，随后这些神经球可分化为胶质细胞和神经元。

方案

1. 准备工作

1. 准备 10 ml 解离培养基，将 200 µl 的 100 倍青霉素-链霉素溶液加入 9.8 ml 的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F12（DMEM/F12）中。
2. 制备 L-半胱氨酸溶液：向 10 ml 组织培养用水中加入 120 mg L-半胱氨酸。L-半胱氨酸溶液可在 4 °C 下保存最多 2 周，或分装后于 -20 °C 保存最多 1 年。
3. 制备 DNase I 溶液：向 1 ml 组织培养用水中加入 10 mg DNase I。DNase I 溶液可在 4 °C 下保存最多 2 个月。
4. 制备木瓜蛋白酶溶液：在 5 ml DMEM/F12 中加入 100 µl 木瓜蛋白酶（约 140 单位）、100 µl DNase I（1%）和 200 µl L-半胱氨酸（12 mg/ml）以制备木瓜蛋白酶溶液。每次使用前需新鲜配制，并在使用前用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。
5. 制备洗涤液：在 93.85 ml 的 1 倍杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）中加入 650 µl 45% 葡萄糖、500 µl 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，1 M）和 5 ml 胎牛血清（FBS），配制成 100 ml 洗涤液。使用前用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌。洗涤液可在 4 °C 下保存最多 2 个月。
6. 制备胰岛素溶液：在 2 ml 组织培养用水中加入 25 µl 的 ....

结果

图1：斑马鱼脑源性神经球的分化。（A–C、E）在Z-分化培养基中培养1天（A，DiVd1）、3天（B，DiVd3）和4天（C 和 D，DiVd4）的全脑源性神经球的相差显微图像。（E）12月龄Tg(GFAP:DsRed)斑马鱼全脑的背侧视图。如图所示，分离并收集端脑（Tel）、视顶盖（Tec）和小脑（Cer）。（D）来自视顶盖、端脑和小脑的DiVd.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPBS 1X	Life Technologies	14190-144
DMEM/F12 1X	Life Technologies	11330-032
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物	Sigma	C6852-25g
B-27	Life Technologies	17504-044
N-2	Life Technologies	17502-048	N-2 补充剂（100倍液）
HEPES	Life Technologies	15630	1M
D-(+)-葡萄糖 45%	Sigma	G8769
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
胎牛血清	Life Technologies	16000044
人碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B
人表皮生长因子	Peprotech	AF-100-15
胰岛素	Sigma	I5500-50 mg
脱氧核糖核酸酶	Sigma	DN25-10mg
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Matrigel	Becton Dickinson	356234
多聚甲醛	TCI	P0018
PBS	AmericanBio	AB11072-04000
三卡因 MS-222	Sigma	A5040	4 mg/ml 储存液
Trycold 凝胶	Sigma	TGP8	凝胶包
台盼蓝染液	Life Technologies	15250061