一种体外生成人脑类器官的方法

摘要

来源：Gabriel, E.，等，利用iPSC衍生的人脑类器官建模早期神经发育障碍。J. Vis. Exp. （2017）

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 脑类器官的生成（23 天）

1. 神经外胚层启动（5天）
   注意： 在开始分化之前，应考虑以下几点。重编程方法（基于慢病毒、基于仙台病毒、基于附加体或基于微小RNA） 等等。为获得人iPSCs，理想情况下应针对所有患者和对照iPSC细胞系采用相同的重编程方法。目前已有多种基于已发表方案的重编程试剂盒及相关操作说明可供使用。人iPSC细胞系的质量是实现最佳分化效果的关键。应使用显微镜监测克隆及细胞形态，并通过检测Oct3/4、Nanog或TRA-1-60等多能性标志物的表达来验证其多能性。
   1. 在涂有Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质的培养皿中，使用培养基A在无饲养层条件下培养人iPSCs。
      注意： 无饲养层且无血清培养人iPSC，以维持明确的培养条件，并避免在启动分化前额外去除小鼠胚胎成纤维饲养层细胞（MEFs）的步骤。人iPSC启动分化时的最佳传代次数范围为重编程后的第15代至总共第70代。传代时，使用适当的细胞解离溶液，以低机械应力将hiPSC克隆作为细胞团块解离，并用2 mL血清学移液管将团块转移至新培养皿中。避免将细胞解离为单细胞，因为这可能在大多数iPSC系中诱导分化和....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F-12	Gibco, 美国	31331093	Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, 美国	P5499	化合物 C
包埋介质	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol；包埋介质；多个供应商
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 基质	Corning	354277	Matrigel hESC 验证级基质；重要：必须为 hESC 验证级
胰岛素	Sigma-Aldrich, 美国	I3536-100MG
L-谷氨酰胺	Gibco, 美国	25030081	L-谷氨酰胺 (200 mM)
培养基 A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1（人诱导多能干细胞培养基）
培养基 B	Stem cell technologies	#05835	神经诱导培养基 (NIM)；神经分化培养基
培养基 C	Gibco, 美国	21103049	神经基础培养基
MEM	Gibco, 美国	11140035	MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)
MycoAlert 支原体检测试剂盒	Lonza, 瑞士	#LT07-218	支原体检测试剂盒；多个供应商
青霉素-链霉素 (10,000 U/ml)	Gibco, 美国	15140122
试剂 A	Stem cell technologies	# 05872	ReLSR（无酶人胚胎干细胞和诱导多能干细胞筛选与传代试剂）；请遵循制造商的操作说明
试剂 B	Sigma-Aldrich, 美国	A6964-100ML	Accutase 溶液是一种用于单细胞解离的酶解溶液；多个供应商；参见操作步骤 1.1.2 "酶解细胞解离溶液"
添加剂 1	Gibco, 美国	17502048	N-2 添加剂 (100x)
添加剂 2（不含维生素 A）	Gibco, 美国	12587010	B-27 添加剂 (50x)，不含维生素 A
SB431542	Selleckchem.com	S1067
250 ml 摇瓶	IBS Integra Bioscience	182026
防水膜	BEMIS 公司	PM996	Parafilm "M"
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK 抑制剂 (Y-27632 2HCL)
β-巯基乙醇	Gibco, 美国	31350010	2-巯基乙醇 (50 mM)