一种体外生成人脑类器官的方法

摘要

来源：Gabriel, E.，等，利用iPSC衍生的人脑类器官建模早期神经发育障碍。J. Vis. Exp. （2017）

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 脑类器官的生成（23 天）

1. 神经外胚层启动（5天）
   注意： 在开始分化之前，应考虑以下几点。重编程方法（基于慢病毒、基于仙台病毒、基于附加体或基于微小RNA） 等等。为获得人iPSCs，理想情况下应针对所有患者和对照iPSC细胞系采用相同的重编程方法。目前已有多种基于已发表方案的重编程试剂盒及相关操作说明可供使用。人iPSC细胞系的质量是实现最佳分化效果的关键。应使用显微镜监测克隆及细胞形态，并通过检测Oct3/4、Nanog或TRA-1-60等多能性标志物的表达来验证其多能性。
   1. 在涂有Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质的培养皿中，使用培养基A在无饲养层条件下培养人iPSCs。
      注意： 无饲养层且无血清培养人iPSC，以维持明确的培养条件，并避免在启动分化前额外去除小鼠胚胎成纤维饲养层细胞（MEFs）的步骤。人iPSC启动分化时的最佳传代次数范围为重编程后的第15代至总共第70代。传代时，使用适当的细胞解离溶液，以低机械应力将hiPSC克隆作为细胞团块解离，并用2 mL血清学移液管将团块转移至新培养皿中。避免将细胞解离为单细胞，因为这可能在大多数iPSC系中诱导分化和凋亡。已有报道指出，长期单细胞传代可能增加人iPSC的基因组变异。避免需要离心步骤以去除解离溶液的细胞解离操作，因为这会降低iPSC的整体存活率。定期检测所有培养物中的微生物污染，特别是支原体，因为这可能改变iPSC的质量及其分化能力。
      1. 按照制造商说明书，用 EHS 基质包被一个 60 mm 组织培养皿。
      2. 解冻一份含有 1 x 10⁶ 人iPSCs。将iPSCs接种于经EHS基质包被并含有5 mL培养基A的60 mm组织培养皿中（参见 材料表每天更换培养基，当细胞融合度达到约80%时，于5至7天后进行传代。
         注意： 在开始分化前，使用标准方法（如无酶法解离细胞集落）对解冻后达到80%融合度的iPSCs进行至少一次传代。简要步骤如下：移除iPSC培养基，用预热至37 °C的Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）洗涤细胞一次，随后按照试剂A生产商说明书推荐方法进行孵育（见材料表）。孵育时间不得超过建议时长，以避免细胞解离为单细胞状态。人iPSCs应以细胞团聚体形式解离并悬浮，不应为单细胞。随后可将细胞转移至新的EHS基质包被培养皿中；例如，一个60 mm培养皿中的iPSC聚集体可分配至4个新的60 mm培养皿中。
         b. 根据制造商说明书，使用支原体检测试剂盒检测支原体。仅使用无支原体的iPSCs，因为支原体可能改变iPSCs的分化能力。
2. 消化iPSCs（80%汇合度），使用试剂B制备单细胞悬液
   1. 用预热（37 °C）的DMEM/F12洗涤iPSCs一次。
   2. 加入预热的试剂B（例如， 1 mL置于60 mm培养皿中），将iPSCs在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟₂.
   3. 用指尖轻拍培养皿的侧面和底部20次，以使诱导多能干细胞（iPSCs）脱落。在显微镜下检查细胞是否已脱落。
   4. 用1 mL微量移液器在培养皿中将细胞悬液上下吹打5次。
   5. 向1 mL试剂B中加入3 mL培养基A进行稀释，并将细胞悬液收集至15 mL离心管中。
   6. 轻轻离心iPSCs（500 × g），室温下离心4分钟。
   7. 将细胞沉淀重悬于1 mL B培养基中，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
      注意： 注意仅使用B培养基进行重悬。避免使用A培养基，因其含有过高浓度的bFGF，可能抑制分化。
3. 将细胞悬液稀释至 4.5 x 10⁵ 每毫升B培养基中加入10 µM Rho相关蛋白激酶抑制剂（Y-27632）。
4. 在非黏附性V型底96孔板中，每孔加入100 µL。
   注意： 每次吸取100 µL细胞悬液前，需轻轻振荡试管，确保细胞在悬液中均匀分布。为获得大小和形态均一（圆形、表面界限清晰）的神经球，每个孔中的细胞数量必须相等。
5. 轻轻将含有细胞的培养板在500 × g条件下离心 g 室温孵育3分钟，随后在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂.
6. 接下来5天内，每天更换培养基，每孔移除50 µL并加入50 µL新鲜的培养基B。

2. 在 EHS 基质中包埋神经球（4 天）

1. 通过混合以下成分制备神经球培养基：DMEM/F12 与 C 培养基按 1:1（v/v）比例混合，1:200（v/v）的添加剂 1，1:100（v/v）不含维生素 A 的添加剂 2，1:100 的 L-谷氨酰胺，0.05 mM 非必需氨基酸（MEM），100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，1.6 g/L 胰岛素，以及 0.05 mM β-巯基乙醇。
2. 使用经无菌剪刀剪去约 2 mm 的吸头，通过 200 µL 微量移液器收集神经球。
3. 将神经球放置在空的 100 mm 培养皿中的石蜡膜（3 × 3 cm²）上，彼此间距约 5 mm，并小心尽可能去除残留的培养基。
4. 在每个单独的神经球上加入一滴（7 µL）EHS 基质胶。
5. 将含有神经球的 EHS 基质胶液滴在培养箱中孵育 15 分钟。
6. 用神经球培养基轻轻冲洗，将神经球从石蜡膜上洗下。冲洗时使用 1 mL 微量移液器，并将神经球转移至含有 10 mL 神经球培养基的新 100 mm 培养皿中。
7. 将神经球继续孵育 4 天，并在第 2 天添加 2 mL 新鲜的神经球培养基。
   注意：确保培养箱内的架子保持水平，以防止嵌入 EHS 基质胶的神经球聚集在培养皿的一侧。

3. 旋转悬浮培养中的类器官（14 天）

1. 通过混合以下成分制备脑类器官培养基：DMEM/F12 与 C 培养基按 1:1（v/v）比例混合，1:200（v/v）补充剂 1，1:100（v/v）不含维生素 A 的补充剂 2，1:100 L-谷氨酰胺，0.05 mM MEM，100 U/mL 青霉素，100 µg/mL 链霉素，1.6 g/L 胰岛素，0.5 µM dorsomorphin，5 µM SB431542，以及 0.05 mM β-巯基乙醇。
2. 通过旋转烧瓶的侧臂向每个烧瓶中加入 100 mL 脑类器官培养基，并将其放入培养箱中预热至少 20 分钟。
3. 根据制造商说明设置搅拌程序，转速为 25 rpm。
   注意：在将包埋于 EHS 基质中的神经球转移至旋转烧瓶前，确保它们彼此分离。若多个神经球通过 EHS 基质相连，需使用手术刀切断连接的基质以进行分离。
4. 使用 2 mL 血清移液管小心地将包埋于 EHS 基质中的神经球转移至含有 100 mL 类器官培养基的旋转烧瓶中。通过旋转烧瓶的侧臂将神经球导入烧瓶内。
5. 将旋转烧瓶置于培养箱内的磁力搅拌平台上，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养；此为类器官培养的第 0 天。
6. 每周更换一次培养基（或在培养基颜色发生变化时更频繁更换），方法是移除一半培养基，并加入等量的新鲜培养基。
   注意：从培养箱中取出旋转烧瓶后，需等待 3–5 分钟，使类器官沉降至瓶底。使用连接泵的玻璃移液管尖端置于液体表面，通过烧瓶的一个侧孔/侧臂小心吸取培养基。所有操作必须在超净工作台内进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F-12	Gibco, 美国	31331093	Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, 美国	P5499	化合物 C
包埋介质	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol；包埋介质；多个供应商
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 基质	Corning	354277	Matrigel hESC 验证级基质；重要：必须为 hESC 验证级
胰岛素	Sigma-Aldrich, 美国	I3536-100MG
L-谷氨酰胺	Gibco, 美国	25030081	L-谷氨酰胺 (200 mM)
培养基 A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1（人诱导多能干细胞培养基）
培养基 B	Stem cell technologies	#05835	神经诱导培养基 (NIM)；神经分化培养基
培养基 C	Gibco, 美国	21103049	神经基础培养基
MEM	Gibco, 美国	11140035	MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)
MycoAlert 支原体检测试剂盒	Lonza, 瑞士	#LT07-218	支原体检测试剂盒；多个供应商
青霉素-链霉素 (10,000 U/ml)	Gibco, 美国	15140122
试剂 A	Stem cell technologies	# 05872	ReLSR（无酶人胚胎干细胞和诱导多能干细胞筛选与传代试剂）；请遵循制造商的操作说明
试剂 B	Sigma-Aldrich, 美国	A6964-100ML	Accutase 溶液是一种用于单细胞解离的酶解溶液；多个供应商；参见操作步骤 1.1.2 "酶解细胞解离溶液"
添加剂 1	Gibco, 美国	17502048	N-2 添加剂 (100x)
添加剂 2（不含维生素 A）	Gibco, 美国	12587010	B-27 添加剂 (50x)，不含维生素 A
SB431542	Selleckchem.com	S1067
250 ml 摇瓶	IBS Integra Bioscience	182026
防水膜	BEMIS 公司	PM996	Parafilm "M"
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK 抑制剂 (Y-27632 2HCL)
β-巯基乙醇	Gibco, 美国	31350010	2-巯基乙醇 (50 mM)