电刺激诱导的神经干细胞和祖细胞分化

摘要

来源：Chang， H. et al.， 微流体器件中电场诱导的神经前体细胞分化。 J. Vis. Exp. （2021）

该视频演示了如何使用细胞外基质涂层的微流控芯片通过电刺激区分神经干细胞和祖细胞或 NPC。接种并粘附到包被区域后，NPC 生长，直流电的应用触发它们分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

方案

1. 多通道、光学透明、延铁 （MOE） 芯片的设计和制造

1. 使用适当的软件为单个聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 层和双面胶带绘制图案（图 1A，材料表）。用 CO₂ 激光机划线机切割 PMMA 片材和双面胶带（图 1B）。
   1. 打开 CO₂ 激光划线机并将其连接到个人计算机。使用软件打开设计的图案文件。
   2. 将 PMMA 片材 （275 mm x 400 mm） 或双面胶带 （210 mm x 297 mm） 放在激光划线机的平台上（图 2A）。使用自动对焦工具将激光聚焦到 PMMA 片材或双面胶带的表面。
   3. 选择激光划线机作为打印机，然后使用激光划线机"打印"图案，开始在 PMMA 片材或双面胶带上直接烧蚀，并在 PMMA 片材或胶带上获得单个图案（图 2B）。
2. 撕下 PMMA 片材上的保护膜，并使用氮气清洁表面。
   注意：PMMA 模型的绘制和 PMMA 片材的直接加工是根据之前的报告进行的。
3. 为了将多层 PMMA 片材粘合在一起，将三片 1 mm PMMA 片材（第 1、2 和 3 层）堆叠在一起，并在 5 kg/cm² 的压力下将它们在 110 °C 的热粘合机中粘合 30 分钟，以形成流动/电刺激通道组件（图 2C）。
   注意：不同批次的市售 PMMA 片材的玻璃化转变温度 （Tg） 略有不同。最佳键合温度需要以接近 Tg 的 5 °C 增量进行测试。
4. 用速效氰基丙烯酸酯胶将 12 个适配器粘附到 MOE 芯片组件第 1 层的各个开口上。
   注意：适配器由 PMMA 注塑制成。底部的平面用于连接 MOE 芯片。带有 1/4W-28 内螺纹的适配器用于连接白色手拧插头、平底连接器或鲁尔接头。使用速效氰基丙烯酸酯胶时要小心。避免溅入眼睛。
5. 在组装芯片之前，使用紫外线 （UV） 照射对 1 mm PMMA 基材（第 1-3 层）、双面胶带（第 4 层）和 3 mm 光学级 PMMA（第 5 层）进行 30 分钟消毒（图 1A）。
6. 用双面胶带（第 4 层）将 1 mm PMMA 基材（第 1-3 层）粘附在 3 mm 光学级 PMMA（第 5 层）上，以完成 PMMA 组件（第 1-5 层）（图 1A）。
7. 为芯片上的组件准备干净的盖玻片。
   将洗涤
   1. 剂的 10 倍稀释液倒入染色罐中（参见材料表），并使用超声波清洁器在该洗涤剂中清洁盖玻片 15 分钟。
   2. 用流动的自来水彻底冲洗染色罐，以去除所有洗涤剂的痕迹。
   3. 继续用蒸馏水冲洗以去除所有自来水痕迹，然后重复步骤 1.7.2 两次。
   4. 用氮气吹干清洁的盖板玻璃。
8. 在组装芯片之前，在生物安全柜内使用紫外线照射对 PMMA 组件（第 1-5 层）、双面胶带（第 6 层）和盖玻片（第 7 层）进行消毒 30 分钟（图 1A）。
9. 用双面胶带（第 7 层）将清洁的盖玻片（第 7 层）粘附到 PMMA 组件（第 1-5 层）上（图 1A）。
10. 将 MOE 芯片在真空室中孵育过夜;使用 MOE 芯片组件进行后续程序（图 3）。

2. 在细胞培养区域的底物上涂覆聚-L-赖氨酸 （PLL）

1. 准备聚四氟乙烯管、平底连接器、锥形连接器、锥形鲁尔适配器、白色手拧插头（也称为塞子）、鲁尔适配器、鲁尔锁注射器和黑色橡胶塞（图 4A，材料表）。将上述所有组分在121°C的高压灭菌器中灭菌30分钟。
2. 用白色手拧塞密封琼脂桥适配器（图 1A）的开口。通过介质入口和出口适配器将平底连接器连接到 MOE 芯片组件（图 4B）。将锥体-鲁尔接头连接到 3 通旋塞阀。
3. 使用连接到培养基入口的 3 通旋塞阀的 3 mL 注射器添加 2 mL 0.01% PLL 溶液（图 4B-）。
4. 将空的 3 mL 注射器连接到介质出口的 3 通旋塞阀（图 4B-）。
5. 用 PLL 溶液填充细胞培养区域。手动缓慢地来回泵送涂层溶液。关闭两个 3 通旋塞阀，将溶液密封在培养区域内。
6. 将 MOE 芯片在 37 °C 下在充满 5% CO₂ 气氛的培养箱中孵育过夜。

3. 盐桥网络的准备

1. 按照步骤 2.6作，打开两个 3 通旋塞阀，使用两个注射器在通道中手动来回泵送涂层溶液，冲走通道中的气泡。
2. 将 3 mL 完全培养基（由 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/Ham 营养混合物 F-12 （DMEM/F12）、2% B-27 补充剂、20 ng/mL EGF 和 20 ng/mL bFGF 组成的干细胞维持培养基）吸入连接到培养基入口的 3 通旋塞阀的 3 mL 注射器中（图 4B- 和图 4B-）。
3. 加入 3 mL 完全培养基以替换细胞培养区域的包被溶液。将空的 5 mL 注射器连接到介质出口的 3 通旋塞阀（图 4B-）。
4. 准备盐桥网络（图 5）。
   1. 切开黑色橡胶塞以产生间隙，然后将银 （Ag）/氯化银 （AgCl） 电极穿过黑色橡胶塞插入鲁尔锁注射器（图 4A）。
   2. 用 Luer 接头替换白色手拧塞，并注入 3% 热琼脂糖以填充 Luer 接头。
      注意：为了制备热琼脂糖，将 3 g 琼脂糖粉末溶解在 100 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在 121 °C 的高压灭菌器中灭菌 30 分钟。
   3. 将 Luer 锁注射器连接到 Luer 适配器。通过黑色橡胶塞注射 3% 热琼脂糖，使用带针头的注射器填充 Luer lock 注射器。让琼脂糖冷却并凝固。
      注意：为了增加琼脂糖的体积容量，将 Luer lock 注射器安装在 Luer 适配器上（图 4 和图 5）。然后，将大电极插入 Luer lock 注射器中。该电极能够为长期实验提供稳定的电刺激。

4. mNPC 的制备

在
1. 37 °C 的 25T 细胞培养瓶中，在充满 5% CO₂ 气氛的培养箱中，在完全培养基中培养 mNPC。每 3-4 天对细胞进行传代培养，并使用从原始来源传代 3-8 次的细胞进行所有实验。
2. 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，并以 100 × g 的速度旋转神经球 5 分钟。吸出上清液并用 1x Dulbecco PBS （DPBS） 洗涤神经球。将神经球以 100 × g 离心 5 分钟。
3. 吸出 1x DPBS，然后将神经球重悬于完全培养基中。充分轻柔地混合。
4. 使用连接到出口的 3 通旋塞阀的 1 mL 注射器添加 1 mL 神经球悬液（图 4B-）。

5. 用于直流脉冲刺激的微流体系统的设置（图 6）

1. 将电池种子 MOE 芯片安装到固定在可编程 X-Y-Z 电动载物台上的透明氧化铟锡 （ITO） 加热器上。
   注意：ITO 表面温度由比例-积分-微分控制器控制，并保持在 37 °C。在芯片和 ITO 加热器之间夹有 K 型热电偶，以监测芯片内细胞培养区域的温度。MOE 芯片安装在可编程的 X-Y-Z 电动载物台上，适用于各个通道部分的自动延时图像采集。ITO 加热器的制造和细胞培养加热系统的设置已在前面描述过。
2. 通过介质出口手动泵入 MOE 芯片，将 mNPC 注入。将细胞接种的 MOE 芯片在 37 °C ITO 加热器上孵育 4 小时。
3. 4 小时后，使用注射泵以 20 μL/h 的流速通过培养基入口将完全培养基泵入 MOE 芯片。
   注意：在电场 （EF） 刺激之前，mNPC 在芯片中生长并维持 24 小时，以允许细胞粘附和生长。废液收集在连接到出口的 3 通旋塞阀的空 5 mL 注射器中，如图 6A 中的"废液"所示。MOE 微流体系统配置如图 6 所示。这种微流控系统为细胞提供持续的营养供应。将完整的新鲜培养基连续泵入 MOE 芯片中，以保持恒定的 pH 值。因此，细胞可以在 CO₂ 培养箱外培养。
4. 使用电线通过芯片上的 Ag/AgCl 电极将 EF 多路复用器连接到 MOE 芯片。将 EF 多路复用器和函数发生器连接到放大器，以 50% 占空比（50% 时间开启和 50% 时间关闭）以 100 Hz 的频率输出幅度为 300 mV/mm 的方波直流脉冲（图 6B）。
   1. 将电线连接到 EF 多路复用器。通过 Ag/AgCl 电极将电线连接到 MOE 芯片。
   2. 使用电线将 EF 多路复用器连接到放大器。将函数发生器连接到放大器和数字示波器。
      注意：EF 多路复用器是一个电路，它将培养室的阻抗包含在电路中，并将所有单独的腔室连接到一个并联的电子网络中。三个培养室中的每一个都串联到多路复用器中的可变电阻器 （Vr） 和电流表（在图 6A 中显示为 μA）。通过控制 Vr 来改变通过每个培养室的电流，电流显示在相应的电流表上。每个细胞培养区域的电场强度由欧姆定律计算，I= σEA，其中 I 是电流，σ（DMEM/F12 设置为 1.38 S·^m-1）是培养基的电导率，E 是电场，A 是刺电室的横截面积。对于图 1 所示的细胞培养区域尺寸，在 50% 占空比下，直流和直流脉冲的电流分别为 ~87 mA 和 ~44 mA。
5. 将 mNPC 以 100 Hz 的频率承受幅度为 300 mV/mm 的方形直流脉冲 48 小时。以 10 μL/h 的速率连续泵送整个培养基，为细胞提供足够的营养并保持培养基中恒定的 pH 值。

结果

图 1：多通道光学透明型式延电芯片的详细配置。（A） MOE 芯片组件的爆炸图。MOE 芯片包括 PMMA 片材 （50 mm x 25 mm x 1 mm）、双面胶带 （50 mm x 25 mm x 0.07 mm）、适配器 （10 mm x 10 mm x 6 mm）、光学级 PMMA 片材 （50 mm x 75 mm x 3 mm）、双面胶带 （24 mm x 60 mm x 0.07 mm）、 和盖玻片（24 mm × 60 mm）。MOE 芯片中有三个细胞培养室。MOE 芯片具有用于培养基入口/出口和琼脂盐桥的连接孔。在细胞培养区域（宽 3 mm x 长 42 mm x 高 0.07 mm）培养细胞。（B） 由适配器、PMMA 片材、双面胶带和盖玻片组成的 MOE 芯片的照片。缩写：MOE= 多通道光学透明触电;PMMA = 聚甲基丙烯酸甲酯。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mm PMMA 基材（第 1-3 层）	BHT	货号 K2R20	聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA），http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL 塑料管	保泰科技企业有限公司	编号 CT-15-PL-TW	锥形底管，带盖，组装好，预灭菌
3 毫升注射器	泰尔茂	DVR-3413	3 mL 口服注射器，无针头
3 mm 光学级 PMMA（第 5 层）	志美公司	ACRYPOLY PMMA 板材	光学级PMMA
三通旋塞阀	日本	NCN-3L	无菌一次性三通旋塞阀
5 毫升注射器	泰尔莫	DVR-3410	5 mL 口服注射器，无针头
适配器	东中股份有限公司	定制	PMMA 适配器
琼脂糖	西格玛奥德里奇	编号 A9414	琼脂糖，低胶凝温度
增幅器	A.A. Lab Systems Ltd	编号： A-304	高压放大器
AutoCAD 软件	欧特克	教育版	起草
B-27 增刊	吉布科	12587-010	维生素 B-27 补充剂 （50x），不含维生素 A
碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）	百科科技	AF-100-18B	也称为重组人 FGF 碱性
黑色橡胶套	泰尔茂	DVR-3413	3 mL 口服注射器起，无针头
牛血清白蛋白 （BSA）	西格玛奥德里奇	B4287	封闭试剂
离心机	翔泰	编号 CV2060	离心机
CO2 激光划线机	激光工具和技术公司	ILS-II	购自 http://www.lttcorp.com/index.htm
锥形接头	IDEX健康与科学	F-120X	一体式手拧 10-32 锥形，适用于 1/16" 外径 天然
锥鲁尔适配器	IDEX健康与科学	P-659	鲁尔接头 10-32 母头 至 母头 鲁尔接头， PEEK
共聚焦荧光显微镜	徕卡显微系统	TCS SP5	Leica TCS SP5 用户手册， http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
数码相机	奥林巴斯	编号 E-330	自动延时图像采集
数字示波器	泰克	TDS2024	测量电子电路或组件中随时间变化的电压或电流信号，以显示幅度和频率。
双面胶带	3M	PET 8018	购买自 http://en.thd.com.tw/
Dulbecco 改良鹰培养基/火腿营养混合物 F-12 （DMEM/F12）	吉布科	12400024	DMEM/F-12、粉末、HEPES
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	吉布科	21600010	DPBS，粉末，不含钙、镁
EF 多路复用器	亚洲天空有限公司	定制	监测和控制各个通道中的电流
表皮生长因子 （EGF）	百科科技	AF-100-15	也称为重组人 EGF
速效氰基丙烯酸酯胶	3M	7004T	强度瞬干胶（液体）
平底连接器	IDEX健康与科学	P-206	无法兰外螺纹 Delrin，1/4-28 平底，用于 1/16" 外径蓝色
函数生成器	安捷伦科技公司	33120A	高性能 15 MHz 合成函数发生器，内置任意波形功能
铟锡氧化物 （ITO） 玻璃	默克	300739	用于 ITO 加热器
K型热电偶	泰佩尔	TPK-02A	温度热电偶
鲁尔适配器	IDEX健康与科学	P618-01	鲁尔接头 母鲁尔接头 至 1/4-28 公头聚丙烯
鲁尔锁注射器	泰尔莫	DVR-3413	琼脂盐桥
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	基本生活	编号：BL2651	洗涤液
聚-L-赖氨酸 （PLL）	SIGMA	货号 P4707	涂层溶液
精密盖板眼镜厚度 No. 1.5H	玛丽恩费尔德	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
可编程 X-Y-Z 电动载物台	Tanlian Inc	定制	购自 http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
比例-积分-微分 （PID） 控制器	东邦电子	TTM-J4-R-AB	温度控制器
PTFE 管	Professional Plastics Inc. 台湾分公司	外径 1/16 英寸	白色半透明 PTFE 管
注射泵	新时代系统公司	NE-1000	NE-1000 可编程单注射泵
TFD4 洗涤剂	弗兰克实验室	TFD4	盖玻片清洁剂
热粘合机	宽民科技有限公司	定制	购买自 http://kmtco.com.tw/
超声波清洗机	狮子座	LEO-300S	超声波消毒器
真空室	邓 永格仪器有限公司	DOV-30	真空干燥箱
白色手拧插头	IDEX健康与科学	P-316	1/4-28 平底 https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html