电刺激诱导的神经干细胞与祖细胞分化

摘要

来源：Chang, H. 等，微流控装置中电场诱导神经前体细胞分化。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用包被细胞外基质的微流控芯片，通过电刺激诱导神经干细胞和祖细胞（NPCs）分化的实验方法。在接种并黏附于包被区域后，NPCs开始生长，施加直流电可触发其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

方案

1. 多通道光学透明趋电性（MOE）芯片的设计与制备

1. 使用适当的软件绘制聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）各层和双面胶带的图案（图1A，材料表）。使用CO₂激光划片机切割PMMA板材和双面胶带（图1B）。
   1. 打开CO₂激光划片机并将其连接至个人计算机。使用软件打开设计好的图案文件。
   2. 将PMMA板材（275 mm × 400 mm）或双面胶带（210 mm × 297 mm）放置在激光划片机的工作平台上（图2A）。使用自动对焦工具将激光聚焦到PMMA板材或双面胶带的表面。
   3. 选择激光划片机作为打印机，然后“打印”图案，启动对PMMA板材或双面胶带的直接烧蚀，从而在PMMA板材或胶带上获得独立的图案（图2B）。
2. 从PMMA板材上移除保护膜，并使用氮气清洁表面。
   注意： PMMA图案的绘制和PMMA板材的直接加工依据先前报道的方法进行。
3. 为将多层PMMA板材键合在一起，堆叠三片1 mm厚的PMMA板材（第1、2和3层），在热压键合机中于110 °C下施加5 kg/cm²的压力键合30分钟，形成流体/电刺激通道组件（图2C）。
   注意： 不同批次的商用PMMA板材玻璃化转变温度（Tg）略有差异。最佳键合温度需在接近Tg的范围内以5 °C为增量进行测试。
4. 使用快干型氰基丙烯酸酯胶水将12个接头粘接到MOE芯片组件第1层的各个开口处。
   注意： 接头由PMMA通过注塑成型制成。底部的平面用于连接MOE芯片。带有1/4W-28内螺纹的接头可用于连接白色手拧塞、平底连接器或鲁尔接头。使用快干型氰基丙烯酸酯胶水时需小心，避免溅入眼睛。
5. 在组装芯片前，使用紫外（UV）照射对1 mm PMMA基底（第1–3层）、双面胶带（第4层）和3 mm光学级PMMA（第5层）进行30分钟的消毒处理（图1A）。
6. 使用双面胶带（第4层）将1 mm PMMA基底（第1–3层）粘接到3 mm光学级PMMA（第5层）上，完成PMMA组件（第1–5层）的组装（图1A）。
7. 为芯片组装准备洁净的盖玻片。
   1. 在染色缸中加入稀释十倍的洗涤剂（见材料表），并将盖玻片放入其中，使用超声波清洗机清洗15分钟。
   2. 在流动自来水下彻底冲洗染色缸，去除所有残留洗涤剂。
   3. 继续用蒸馏水冲洗以去除所有自来水残留，并重复步骤1.7.2两次。
   4. 用氮气吹干已清洗的盖玻片。
8. 在生物安全柜内使用紫外照射对PMMA组件（第1–5层）、双面胶带（第6层）和盖玻片（第7层）进行30分钟的消毒处理，然后进行芯片组装（图1A）。
9. 使用双面胶带（第6层）将清洁后的盖玻片（第7层）粘接到PMMA组件（第1–5层）上（图1A）。
10. 将MOE芯片置于真空腔室中孵育过夜；随后使用该MOE芯片组件进行后续实验操作（图3）。

2. 在细胞培养区域的基底上包被多聚-L-赖氨酸（PLL）

1. 准备聚四氟乙烯管、平底连接器、锥形连接器、锥形-鲁尔接头、白色指旋塞（也称为塞子）、鲁尔接头、鲁尔锁注射器和黑色橡胶塞（图4A，材料表）。将上述所有组件在121 °C下高压灭菌30分钟。
2. 用白色指旋塞密封琼脂桥接头的开口（图1A）。通过培养基入口和出口接头将平底连接器连接至MOE芯片组件（图4B）。将锥形-鲁尔接头连接至三通旋塞阀。
3. 使用连接至培养基入口三通旋塞阀的3 mL注射器加入2 mL的0.01% PLL溶液（图4B-）。
4. 将一个空的3 mL注射器连接至培养基出口的三通旋塞阀（图4B-）。
5. 用PLL溶液填充细胞培养区域。手动缓慢地来回推动包被溶液。关闭两个三通旋塞阀，使溶液密封在培养区域内。
6. 将MOE芯片置于含5% CO₂气氛的培养箱中，在37 °C下孵育过夜。

3. 盐桥网络的制备

1. 完成步骤 2.6 后，打开两个三通旋塞，使用两个注射器手动来回推动包被溶液，将通道中的气泡冲洗排出。
2. 将 3 mL 完全培养基（干细胞维持培养基，包含 DMEM/F12 培养基、2% B-27 添加剂、20 ng/mL EGF 和 20 ng/mL bFGF）吸入一个连接至培养基入口三通旋塞的 3 mL 注射器中（图 4B- 和 图 4B-）。
3. 加入 3 mL 完全培养基，以替换细胞培养区域中的包被溶液。将一个空的 5 mL 注射器连接至培养基出口的三通旋塞（图 4B-）。
4. 制备盐桥网络（图 5）。
   1. 将黑色橡胶塞切开形成缝隙，将银（Ag）/氯化银（AgCl）电极穿过黑色橡胶塞并插入鲁尔锁式注射器中（图 4A）。
   2. 用鲁尔接头替换白色手拧塞，并注入 3% 热琼脂糖以填满鲁尔接头。
      注意：制备热琼脂糖时，将 3 g 琼脂糖粉末溶解于 100 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   3. 将鲁尔锁式注射器连接至鲁尔接头。使用带针头的注射器通过黑色橡胶塞注入 3% 热琼脂糖，以填满鲁尔锁式注射器。静置 10 至 20 分钟，使琼脂糖冷却并凝固。
      注意：为增加琼脂糖的容量，将鲁尔锁式注射器安装在鲁尔接头上（图 4 和 图 5）。随后将较大的电极插入鲁尔锁式注射器中。该电极可为长期实验提供稳定的电刺激。

4. mNPC 的制备

1. 将mNPCs在含有完全培养基的25T细胞培养瓶中，于37 °C、5% CO₂的培养箱中进行培养。每3-4天传代一次，所有实验均使用从原始来源传代3-8次的细胞进行。
2. 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，以100 × g离心5分钟，使神经球沉淀。吸除上清液，并用1×杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤神经球。再次以100 × g离心5分钟。
3. 吸除1× DPBS，然后将神经球重悬于完全培养基中，轻轻混匀。
4. 使用连接至出口三通阀的1 mL注射器加入1 mL神经球悬液（图4B-）。

5. 用于 DC 脉冲刺激的微流控系统设置（图6）

1. 将接种细胞的 MOE 芯片安装到固定在可编程 X-Y-Z 电动平台上的透明氧化铟锡（ITO）加热器上。
   注意： ITO 表面温度由比例-积分-微分控制器控制，并维持在 37 °C。将 K 型热电偶夹在芯片与 ITO 加热器之间，用于监测芯片内细胞培养区域的温度。MOE 芯片安装在可编程 X-Y-Z 电动平台上，适用于在各个通道截面进行自动延时图像采集。ITO 加热器的制备及细胞培养加热系统的搭建方法此前已有报道。
2. 通过手动泵送方式，将 mNPCs 经由培养基出口注入 MOE 芯片中。将接种细胞的 MOE 芯片在 37 °C 的 ITO 加热器上孵育 4 小时。
3. 孵育 4 小时后，使用注射泵以 20 µL/h 的流速经由培养基入口向 MOE 芯片中泵入完全培养基。
   注意： mNPCs 在芯片中继续培养并维持 24 小时后再进行电场（EF）刺激，以确保细胞充分贴壁和生长。废液被收集至连接在出口三通旋塞上的空 5 mL 注射器中，如图 6A中“waste”所示。MOE 微流控系统配置如图 6所示。该微流控系统可为细胞持续提供营养物质。新鲜完全培养基持续泵入 MOE 芯片，以维持恒定的 pH 值。因此，细胞可在 CO₂ 培养箱外进行培养。
4. 使用导线将电场多路复用器（EF multiplexer）通过芯片上的 Ag/AgCl 电极与 MOE 芯片连接。将电场多路复用器和函数发生器连接至放大器，输出幅值为 300 mV/mm、频率为 100 Hz、占空比为 50%（50% 开启时间，50% 关闭时间）的方波直流脉冲（图 6B）。
   1. 将导线连接至电场多路复用器。通过芯片上的 Ag/AgCl 电极将导线连接至 MOE 芯片。
   2. 使用导线将电场多路复用器连接至放大器。将函数发生器连接至放大器和数字示波器。
      注意： 电场多路复用器是一种电路，其将培养腔室的阻抗纳入电路中，并将所有独立腔室连接成并联电子网络。每个三个培养腔室在电路中依次串联一个可变电阻（Vr）和一个电流表（如图 6A中 µA 所示）。通过调节可变电阻（Vr）来改变流经每个培养腔室的电流，电流值显示在对应的电流表上。各细胞培养区域中的电场强度根据欧姆定律 I = σEA 计算，其中 I 为电流，σ（DMEM/F12 培养基设为 1.38 S·m^-1）为培养基的电导率，E 为电场，A 为电趋化腔室的横截面积。对于图 1所示的细胞培养区域尺寸，直流电（DC）和占空比为 50% 的直流脉冲对应的电流分别约为 87 mA 和 44 mA。
5. 对 mNPCs 施加幅值为 300 mV/mm、频率为 100 Hz 的方波直流脉冲，持续 48 小时。同时以 10 µL/h 的速率持续泵入完全培养基，为细胞提供充足的营养物质，并维持培养基中恒定的 pH 值。

结果

图1：多通道光学透明电趋性芯片的详细结构。（A）MOE芯片组件的爆炸图。MOE芯片由PMMA片材（50 mm × 25 mm × 1 mm）、双面胶带（50 mm × 25 mm × 0.07 mm）、接头（10 mm × 10 mm × 6 mm）、光学级PMMA片材（50 mm × 75 mm × 3 mm）、双面胶带（24 mm × 60 mm × 0.07 mm）以及盖玻片（24 mm × 60 mm）组成。MOE芯片内设有三个细胞培养腔室。芯片上设有用于培养基进/出口和琼脂盐桥连接的通孔。细胞培养区域尺寸为宽3 mm × 长42 mm × 高0.07 mm。（B）包含接...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mm PMMA基底（第1-3层）	BHT	K2R20	聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL塑料管	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	带盖锥底管，已组装，预灭菌
3 mL注射器	TERUMO	DVR-3413	3 mL口服注射器，无针头
3 mm光学级PMMA（第5层）	CHI MEI Corporation	ACRYPOLY PMMA Sheet	光学级PMMA
三通旋塞阀	NIPRO	NCN-3L	无菌一次性三通旋塞阀
5 mL注射器	TERUMO	DVR-3410	5 mL口服注射器，无针头
接头	Dong Zhong Co., Ltd.	Customized	PMMA接头
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414	琼脂糖，低凝胶温度
放大器	A.A. Lab Systems Ltd	A-304	高压放大器
AutoCAD软件	Autodesk	Educational Version	制图
B-27添加剂	Gibco	12587-010	B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Peprotech	AF-100-18B	又称重组人FGF-basic
黑色橡胶塞	TERUMO	DVR-3413	取自3 mL口服注射器，无针头
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	B4287	封闭试剂
离心机	HSIANGTAI	CV2060	离心机
CO2激光划片机	Laser Tools and Technics Corp.	ILS-II	购自http://www.lttcorp.com/index.htm
锥形连接器	IDEX Health & Science	F-120X	一体式手拧10-32锥形接头，适用于外径1/16"天然材质管
锥形-鲁尔接头	IDEX Health & Science	P-659	鲁尔接头，10-32母头转鲁尔母头，PEEK材质
共聚焦荧光显微镜	Leica Microsystems	TCS SP5	Leica TCS SP5用户手册，http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
数码相机	OLYMPUS	E-330	自动延时图像采集
数字示波器	Tektronix	TDS2024	测量电子电路或元件中随时间变化的电压或电流信号，以显示其幅值和频率
双面胶带	3M	PET 8018	购自http://en.thd.com.tw/
DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物）	Gibco	12400024	DMEM/F-12，粉末，含HEPES
磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	21600010	DPBS，粉末，无钙，无镁
EF多路复用器	Asiatic Sky Co., Ltd.	Customized	监测并控制各通道中的电流
表皮生长因子（EGF）	Peprotech	AF-100-15	又称重组人EGF
快干型氰基丙烯酸酯胶水	3M	7004T	高强度瞬干胶（液体）
平底连接器	IDEX Health & Science	P-206	无法兰雄螺母Delrin材质，1/4-28平底，适用于外径1/16"蓝色管
函数发生器	Agilent Technologies	33120A	高性能15 MHz合成函数发生器，内置任意波形生成功能
氧化铟锡（ITO）玻璃	Merck	300739	用于ITO加热器
K型热电偶	Tecpel	TPK-02A	温度热电偶
鲁尔接头	IDEX Health & Science	P618-01	鲁尔接头，鲁尔母头转1/4-28雄头聚丙烯材质
鲁尔锁式注射器	TERUMO	DVR-3413	用于琼脂盐桥
磷酸盐缓冲液（PBS）	Basic Life	BL2651	洗涤液
聚-L-赖氨酸（PLL）	SIGMA	P4707	包被溶液
精密盖玻片，厚度1.5H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
可编程X-Y-Z电动载物台	Tanlian Inc	Customized	购自http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
比例-积分-微分（PID）控制器	Toho Electronics	TTM-J4-R-AB	温度控制器
PTFE管	Professional Plastics Inc. Taiwan Branch	外径1/16英寸	白色半透明PTFE管
注射泵	New Era Systems Inc	NE-1000	NE-1000可编程单通道注射泵
TFD4清洗剂	FRANKLAB	TFD4	盖玻片清洁剂
热压键合机	Kuan-MIN Tech Co.	Customized	购自http://kmtco.com.tw/
超声波清洗机	LEO	LEO-300S	超声波灭菌清洗机
真空腔室	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	真空干燥箱
白色手拧堵头	IDEX Health & Science	P-316	1/4-28平底，https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html