生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

摘要

来源：Koch, L. S., 等. 用于衰老研究的iPSC来源脑类器官的长期培养的稳健组织制备方法. J. Vis. Exp. (2023).

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

图1 展示了本实验方案工作流程的示意图。

1. 诱导多能干细胞重编程与维持

1. 将受试者（老年或疾病患者，年龄65岁及以上）的8 mL血液收集到含柠檬酸钠的细胞分离管（CPT）中，或收集到乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素抗凝管中。
2. 在室温（RT）下以1,800 × g 离心30分钟，收集仅含外周血细胞而无血清的沉淀物。
3. 根据制造商说明书（见材料表）使用特制的重编程载体以获得诱导性多能干细胞（iPSCs）。
4. 将iPSCs培养于无饲养层、无乳酸脱氢酶升高病毒（LDEV）污染、经低生长因子基底膜基质包被的6孔培养板中，使用Essential 8（E8）培养基，在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养（见材料表）。
5. 在E8培养基中维持iPSCs培养3至4天，以避免细胞过度生长或自发分化。
6. 利用免疫荧光标记法（步骤2）验证iPSC系的多能性，并进行支原体检测（步骤3）。

2. 多能性染色....

结果

图1：本方法的工作流程与时间线示意图。

图 2：脑类器官的分化与成熟。 （A）70%–80% 汇合度的诱导多能干细胞（iPSC）培养的代表性图像。（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-β-巯基乙醇	Thermo Fisher Scientific	31350010
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Invitrogen	D1306	67:40:00
6孔透明平底CELLSTAR细胞培养多孔板	Greiner Bio-One	657185
6孔透明平底超低吸附培养板	Corning	3471
96孔透明圆底超低吸附微孔板	Corning	7007
96孔Nunclon Delta处理平底微孔板	Thermo Fisher Scientific	136101
Accutase	Sigma-Aldrich	46964	细胞解离溶液
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）	Gibco	15240062
B27添加剂（含维生素A）（50倍浓缩液）	Gibco	17504044
B27添加剂（不含维生素A）（50倍浓缩液）	Gibco	12587010
BD Vacutainer™ 玻璃单个核细胞分离管（CPT管）	Thermo Fisher Scientific	02-685-125
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418
离心机	Eppendorf	5810 R	带板架
CHIR99021	Selleck Chemicals	S2924
CytoTune仙台病毒重编程载体	Thermo Fisher Scientific	A1378001
ddPCR引物 | 人源 | MAPT	Bio-Rad	dHsaCPE192234
ddPCR引物 | 人源 | RBFOX3 (NeuN)	Bio-Rad	dHsaCPE5052108
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320074
双皮质素（DCX）	Santa Cruz Biotechnology	SC-8066	09:20
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Thermo Fisher Scientific	14190144	无钙、无镁
Eppendorf离心管，1.5 mL	Eppendorf	0030 125.215
Essential 6	Gibco	A1516401
Essential 8	Gibco	A1517001
乙二胺四乙酸（EDTA）	Invitrogen	15575020
Falcon离心管，15 mL，锥形	Greiner Bio-One	188271-N
甲醛	Sigma-Aldrich	252549	37% 储存液，用PBS稀释至4%
Geltrex LDEV-Free低生长因子基底膜基质	Thermo Fisher Scientific	A1413202
GlutaMax（100倍浓缩液）	Gibco	35050038
血细胞计数板细胞计数器	Hausser scientific	1490
HEPES缓冲液	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
胰岛素	Sigma-Aldrich	I9278
LDN 193189	StemCell Technologies	72147
MAP2	Abcam	ab32454	04:20
Matrigel低生长因子（GFR）基底膜基质，LDEV-free	Corning	356230	基底膜基质
MEM-非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA；100倍浓缩液）	Thermo Fisher Scientific	11140050
多功能微孔板检测仪 Victor 3	Perkin Elmer	1420	发光检测仪
MycoAlert支原体检测试剂盒	Lonza	LT07-318
N-2添加剂（100倍浓缩液）	Thermo Fisher Scientific	17502-048
NeuN	Millipore	MAB377	09:20
Neurobasal培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049
Oct-3/4抗体（C-10）Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279 AF647	02:40
Parafilm	Bemis	PM-996	热塑性薄膜
PAX6	Thermo Fisher Scientific	42-6600	04:20
青霉素/链霉素	Gibco	15070063
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微丝	Ethicon	J463
QX200微滴数字PCR系统	Bio-Rad	1864001
ROCK抑制剂（Y27632）	Selleck Chemicals	S1049
SB431542	R&D Systems	1614/50
SOX2单克隆抗体（Btjce），Alexa Fluor 488，eBioscience	Invitrogen	53-9811-80	02:40
突触素I（SYN）	Calbiochem	574777	04:20
吐温-100（Triton-X 100）	Sigma-Aldrich	T8787
TUJ1	Santa Cruz Biotechnology	sc-80005	β-3微管蛋白；1:500
XAV939	Tocris Bioscience	3748