生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

摘要

来源：Koch, L. S., 等. 用于衰老研究的iPSC来源脑类器官的长期培养的稳健组织制备方法. J. Vis. Exp. (2023).

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

图1 展示了本实验方案工作流程的示意图。

1. 诱导多能干细胞重编程与维持

1. 将受试者（老年或疾病患者，年龄65岁及以上）的8 mL血液收集到含柠檬酸钠的细胞分离管（CPT）中，或收集到乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素抗凝管中。
2. 在室温（RT）下以1,800 × g 离心30分钟，收集仅含外周血细胞而无血清的沉淀物。
3. 根据制造商说明书（见材料表）使用特制的重编程载体以获得诱导性多能干细胞（iPSCs）。
4. 将iPSCs培养于无饲养层、无乳酸脱氢酶升高病毒（LDEV）污染、经低生长因子基底膜基质包被的6孔培养板中，使用Essential 8（E8）培养基，在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养（见材料表）。
5. 在E8培养基中维持iPSCs培养3至4天，以避免细胞过度生长或自发分化。
6. 利用免疫荧光标记法（步骤2）验证iPSC系的多能性，并进行支原体检测（步骤3）。

2. 多能性染色

1. 为节约试剂和抗体，分析前3-4天将细胞接种于已包被（步骤1.4）的24孔培养板中。用移液器吸除培养基，并在室温下用磷酸盐缓冲液（1× PBS）中含4%甲醛的溶液固定细胞15-20分钟。
2. 用1× PBS洗涤细胞3次，然后在室温下用含1%牛血清白蛋白（BSA）的0.1% Triton-X 100溶液对细胞进行透化处理，时间至少15分钟，但不超过1小时。
3. 再次用1× PBS洗涤3次，随后在室温下用含5% BSA的PBS溶液封闭30分钟。
4. 再次用1× PBS洗涤3次，加入Sox2和Oct3/4抗体（1:100稀释；参见材料表）以及核酸染料DAPI（1% BSA中1:4,000稀释），4 °C孵育过夜。用铝箔包裹以避光。
5. 用1× PBS洗涤3次，将细胞保留在PBS中。使用荧光显微镜在10-20倍放大倍数下进行成像。确认多能性标志物Y型盒转录因子2（Sox2）和八聚体结合转录因子3/4（Oct3/4）定位于细胞核内。

3. 支原体检测

注意：有关详细的检测操作和分析步骤，请参考检测试剂盒的说明书（见材料表）。该检测试剂盒提供用于支原体检测的试剂、底物和检测缓冲液。

1. 在传代细胞或更换培养基之前，收集 2-3 mL 细胞培养基至离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞或碎片。将上清液于 4 °C 保存，保存时间不超过 5 天。将细胞与培养基共同孵育至少 24 小时，以确保可检测到信号。
2. 取 100 µL 细胞上清液加入新的离心管或白色壁 96 孔板的孔中（推荐使用不透明底板，参见材料表）。用检测缓冲液重悬试剂和底物，并在室温下平衡 15 分钟。
3. 向样品中加入 100 µL 试剂，在室温下孵育 5 分钟。使用化学发光仪测量发光值（测量值 #1）。
4. 向样品中加入 100 µL 底物，在室温下孵育 10 分钟。测量发光值（测量值 #2）。
5. 通过测量值 #2 与 #1 的比值判断支原体污染情况。结果解读请参考试剂盒说明书。

4. 微丝制备

1. 使用手术刀的钝端将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，参见材料表）缝合线解开松散，然后用70%乙醇轻轻喷洒处理松散的纤维。
2. 在显微镜下，借助尺子将PLGA纤维切割成长度为500 µm至1 mm的片段，总共切割约25 mm。将切割后的纤维丝保存在15 mL离心管中，并加入1 mL抗生素-抗真菌溶液。
   1. 在生物安全柜中，用10 mL DMEM/F-12（表1）稀释纤维溶液，充分涡旋混匀。
      ​注意：操作需在细胞培养超净台的无菌环境中进行。
3. 向96孔板中三个用于胚胎体（EB）形成的孔中各加入20 µL纤维溶液。在明场显微镜下计数每孔中的纤维数量并计算平均值，调整浓度使每孔平均含有5–10根PLGA微纤维。以相同方式准备每个孔。
4. 此时，各孔已准备好接种细胞。若暂不使用，可将培养板置于室温保存，或于4 ˚C保存至次日。

5. 胚状体（EB）形成

注意：所有培养基和溶液必须预热至室温。

1. 当iPSCs达到70%-80%融合度（图2A）时，即可进行传代并用于拟胚体（EB）形成。在10x-20x显微镜下观察细胞，确保克隆中自发分化的区域极少（<10%）。
2. 用移液器吸除培养基，并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次。加入500 µL细胞解离溶液（见材料表）或0.5 mM EDTA，于37 °C孵育3-5分钟。
   注意：操作需在无菌环境下的细胞培养生物安全柜中进行。
3. 向每孔加入1 mL新鲜E8培养基，轻柔吹打，收集解离的细胞，直至所有细胞脱离。
4. 将1.5 mL细胞悬液转移至15 mL离心管中，再加入1 mL新鲜E8培养基，使总体积达到2.5 mL。
5. 在室温下以290 x g离心3分钟。
6. 用移液器吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL Essential 6（E6，见材料表）培养基中，该培养基需添加50 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
7. 根据所需的接种密度，用添加了50 µM ROCK抑制剂的E6培养基（见材料表）配制浓度为60,000-90,000个细胞/mL的细胞悬液。
8. 向每个96孔超低吸附（ULA）板（或预先准备的凹形板）的孔中加入150 µL细胞悬液，每孔接种9,000-11,000个细胞。
9. 将板在室温下以290 x g离心1分钟，促使细胞聚集。随后将板置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。

6. 神经上皮诱导

1. 24小时后，用移液器小心吸出120 µL培养基。注意不要将移液器吸头插入过深而吸入拟胚体（EB）。
2. 每孔加入150 µL室温的E6培养基，其中添加2 µM XAV939以及母亲抗十胜蛋白抑制因子（SMAD）抑制剂：10 µM SB431542和500 nM LDN 193189（参见材料表）。
3. 每天更换新鲜配制的E6培养基，其中添加2 µM XAV939、10 µM SB431542和500 nM LDN 193189。
   注意：至第6天（DIV6），拟胚体直径应达到550–600 µm，可进行后续分化。

7. 类器官的分化与成熟

注意：所有培养基均需预热至室温。

1. 在大约 DIV7 时，检查所有类胚体（EBs）是否均已达到直径 550–600 µm，并呈现光滑清晰的边缘（图 2B）；此时它们已准备好嵌入细胞外基质（ECM）中。
   注意：操作需在无菌环境中进行。
2. 使用热塑性封膜（见材料表）制备带凹面的包埋片：将一段约 4 英寸长的膜片放置于空的 P200 盒上，用 15 mL 离心管或 500 µL 微量离心管轻轻将膜片压入孔中，形成 12 个凹面。用 70% 乙醇喷洒膜片，并在超净台内打开紫外灯至少 30 分钟使其干燥。
3. 将足量的基底膜基质（Matrigel，见材料表）置于冰上解冻，并放入超净台中。
   注意：每个类胚体约需 30 µL 未稀释的基质。务必使基质温度始终低于 4 °C，以防其发生凝胶化。建议使用预冷的移液枪吸头，以减缓基质在吸头内聚合，从而减少材料损耗。
4. 使用宽口 P200 吸头将一个类胚体转移至每个凹面中，并用普通移液枪吸头尽可能吸除培养基，注意避免类胚体干燥。使用常规 P200 吸头向每个类器官加入约 30 µL 未稀释的基底膜基质，确保类胚体位于液滴中央。
5. 当所有类胚体均嵌入基质后，将含有类胚体的膜片放入无菌培养皿中。
   注意：可选操作：可在大培养皿内靠近膜片处放置一个小培养皿，内盛无菌水，以防止蒸发。
   1. 将培养皿转移至培养箱，在 37 ˚C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育约 10 分钟，使基底膜基质固化。
6. 对于每组 12 个已包埋的类器官，在超低吸附 6 孔板（ULA 6-well plate）的一个孔中配制 5 mL 含 B27（不含维生素 A）的分化培养基（表 1），并将该孔板在培养箱中预热至 37 °C。
7. 孵育结束后，通过从膜片背面轻推凹面的方式，将包埋的类胚体转移至 ULA 6 孔板中。如有需要，可从孔中取出 1 mL 培养基，滴加到膜片上以帮助液滴脱离膜表面。
   注意：包埋后 1 天即可观察到重要的形态学变化；类胚体从边缘光滑转变为出现隆起的突起并形成芽状结构（图 2C）。
8. 在第 2 天（DIV9）进行半量换液。操作过程中注意避免吸除或损伤基底膜基质液滴。
9. 再过 2 天后（DIV11），进行全量换液，并在培养基中添加 3 µM 的 CHIR99021（见材料表）。
10. 在 DIV14 时，更换为含 B27（含维生素 A）的分化培养基（表 1），以逐步促进类器官体积增大。
11. 在 DIV16 时，将培养板置于培养箱内的轨道摇床上，以 90 rpm 振荡培养，并每 2 天更换一次培养基。
12. 每 40 天（DIV），为每 50 mL 培养基添加 500 µL 基底膜基质，以提供额外营养。

表1：本研究中使用的分化培养基的成分。

试剂	终浓度	体积（总体积 50 mL）
DMEM-F12	50%	25 mL
Neurobasal 培养基	50%	25 mL
N2 补充剂 (100x)	1x	0.25 mL
B27 补充剂 -/+ 维生素 A (50x)	0.5x	0.5 mL
胰岛素	0.25%	12.5 µL
GlutaMAX (100x)	1x	0.5 mL
MEM-NEAA (100x)	0.5x	0.25 mL
HEPES (1 M)	10 mM	0.5 mL
抗生素/抗真菌剂 (100x)	1x	0.5 mL
2-β-巯基乙醇	50 µM	17.5 µL
注意：某些 DMEM-F12 已含有 GlutaMAX，无需额外添加。

结果

图1：本方法的工作流程与时间线示意图。

图 2：脑类器官的分化与成熟。 （A）70%–80% 汇合度的诱导多能干细胞（iPSC）培养的代表性图像。（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-β-巯基乙醇	Thermo Fisher Scientific	31350010
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Invitrogen	D1306	67:40:00
6孔透明平底CELLSTAR细胞培养多孔板	Greiner Bio-One	657185
6孔透明平底超低吸附培养板	Corning	3471
96孔透明圆底超低吸附微孔板	Corning	7007
96孔Nunclon Delta处理平底微孔板	Thermo Fisher Scientific	136101
Accutase	Sigma-Aldrich	46964	细胞解离溶液
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）	Gibco	15240062
B27添加剂（含维生素A）（50倍浓缩液）	Gibco	17504044
B27添加剂（不含维生素A）（50倍浓缩液）	Gibco	12587010
BD Vacutainer™ 玻璃单个核细胞分离管（CPT管）	Thermo Fisher Scientific	02-685-125
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418
离心机	Eppendorf	5810 R	带板架
CHIR99021	Selleck Chemicals	S2924
CytoTune仙台病毒重编程载体	Thermo Fisher Scientific	A1378001
ddPCR引物 | 人源 | MAPT	Bio-Rad	dHsaCPE192234
ddPCR引物 | 人源 | RBFOX3 (NeuN)	Bio-Rad	dHsaCPE5052108
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320074
双皮质素（DCX）	Santa Cruz Biotechnology	SC-8066	09:20
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Thermo Fisher Scientific	14190144	无钙、无镁
Eppendorf离心管，1.5 mL	Eppendorf	0030 125.215
Essential 6	Gibco	A1516401
Essential 8	Gibco	A1517001
乙二胺四乙酸（EDTA）	Invitrogen	15575020
Falcon离心管，15 mL，锥形	Greiner Bio-One	188271-N
甲醛	Sigma-Aldrich	252549	37% 储存液，用PBS稀释至4%
Geltrex LDEV-Free低生长因子基底膜基质	Thermo Fisher Scientific	A1413202
GlutaMax（100倍浓缩液）	Gibco	35050038
血细胞计数板细胞计数器	Hausser scientific	1490
HEPES缓冲液	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
胰岛素	Sigma-Aldrich	I9278
LDN 193189	StemCell Technologies	72147
MAP2	Abcam	ab32454	04:20
Matrigel低生长因子（GFR）基底膜基质，LDEV-free	Corning	356230	基底膜基质
MEM-非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA；100倍浓缩液）	Thermo Fisher Scientific	11140050
多功能微孔板检测仪 Victor 3	Perkin Elmer	1420	发光检测仪
MycoAlert支原体检测试剂盒	Lonza	LT07-318
N-2添加剂（100倍浓缩液）	Thermo Fisher Scientific	17502-048
NeuN	Millipore	MAB377	09:20
Neurobasal培养基	Thermo Fisher Scientific	21103049
Oct-3/4抗体（C-10）Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279 AF647	02:40
Parafilm	Bemis	PM-996	热塑性薄膜
PAX6	Thermo Fisher Scientific	42-6600	04:20
青霉素/链霉素	Gibco	15070063
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微丝	Ethicon	J463
QX200微滴数字PCR系统	Bio-Rad	1864001
ROCK抑制剂（Y27632）	Selleck Chemicals	S1049
SB431542	R&D Systems	1614/50
SOX2单克隆抗体（Btjce），Alexa Fluor 488，eBioscience	Invitrogen	53-9811-80	02:40
突触素I（SYN）	Calbiochem	574777	04:20
吐温-100（Triton-X 100）	Sigma-Aldrich	T8787
TUJ1	Santa Cruz Biotechnology	sc-80005	β-3微管蛋白；1:500
XAV939	Tocris Bioscience	3748