来源：Stoklund Dittlau, K. 等，在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元。J. Vis. Exp. (2021)
该视频展示了利用微流控装置形成神经肌肉接头的过程。将神经前体细胞和肌源性前体细胞分别接种到装置内的不同小室中，并使其分别成熟为运动神经元和肌管。通过建立体积和化学梯度，诱导形成具有活性的神经肌肉接头。
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使用微流控装置生成神经肌肉接头
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。
本方案中使用的所有试剂和设备均列于材料表中，应使用无菌的试剂和设备。除非另有说明，培养基在使用前应加热至室温（RT）。有关共培养方案的概述，请参见图1。
1. 诱导多能干细胞（iPSCs）向运动神经元前体细胞的分化
- 按照先前研究改编的运动神经元分化方案进行操作，直至获得第10天的神经前体细胞（NPCs）。根据该方案的时间安排，分化起始于星期一（第0天），到星期四时获得第10天的NPCs。
- 将第10天的NPCs以每管2 × 106–4 × 106个细胞的密度，在含10%二甲基亚砜（DMSO）的无血清替代物中进行冷冻保存。
注意：DMSO具有毒性：操作时应在通风橱内佩戴个人防护装备。
备注：预计第10天NPCs在解冻后约有50%的细胞具有活力。在此“第10天NPC”阶段暂停运动神经元分化流程，并对NPCs进行冷冻保存，以便大量储备后续使用，从而将共培养方案的总时长从28天缩短至19天。
2. 人类中血管母细胞（MABs）的分离与培养
注意：MABs 是血管相关性间充质干细胞，本实验中取自一位 58 岁健康供体的活检组织。也可使用其他商业来源。此处简要说明获取 MABs 的方案。如需更多信息，请参考详细方案。所有 MABs 培养基在使用前应加热至 37 °C。
- 将活检组织切碎，并在涂有胶原蛋白（来自小牛皮）的6 cm培养皿中，使用生长培养基（表1）孵育2周。每4天更换一次培养基。
- 制备胶原蛋白包被液：将100 mg胶原蛋白溶解于20 mL 0.1 M乙酸中。胶原蛋白溶解较慢，需将混合物在室温下置于摇床上过夜。次日，加入80 mL ddH2O，定容至100 mL。
注意：乙酸具有毒性，操作时应在通风橱内佩戴个人防护装备。
备注：小牛皮来源的胶原蛋白包被液最多可重复使用5次，4 °C保存。 - 用胶原蛋白完全覆盖培养皿或培养瓶表面，盖好后在超净台内室温孵育20分钟。20分钟后，将胶原蛋白溶液回收至新容器中，盖上空的培养皿或培养瓶，在超净台内室温静置10分钟。
- 将培养皿或培养瓶转移至培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下过夜（或至少6小时）孵育。接种细胞前，用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤5次。
- 制备胶原蛋白包被液：将100 mg胶原蛋白溶解于20 mL 0.1 M乙酸中。胶原蛋白溶解较慢，需将混合物在室温下置于摇床上过夜。次日，加入80 mL ddH2O，定容至100 mL。
- 14天后，通过FACS（荧光激活细胞分选）对MABs进行人碱性磷酸酶分选，随后进一步扩增。将MABs维持在胶原蛋白包被的T75培养瓶中，使用生长培养基培养，每2天更换一次培养基（每瓶10 mL）。
- 当MABs达到70%融合度时，进行冻存、传代或接种至实验装置。
备注：MABs在细胞间接触后会因自发融合而丧失成肌潜能。扩增MABs时，应确保融合度不超过70%。一个70%融合度的T75培养瓶约含有600,000–800,000个细胞，可按每管100,000个细胞进行冻存。每管细胞日后可解冻并接种至T75培养瓶中进行扩增。 - 传代MABs时，先用7 mL DPBS轻柔洗涤一次，然后加入7 mL MAB解离液，在37 °C、5% CO2条件下孵育3分钟以解离细胞。
- 加入7 mL生长培养基中和MAB解离液，轻柔刮取细胞，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。再用额外5 mL生长培养基轻柔冲洗培养瓶，以收集可能残留的MABs。
- 将细胞悬液在300 × g条件下离心3分钟，随后直接接种至新的胶原蛋白包被T75培养瓶中进行扩增，或使用含10% DMSO的无血清替代物进行冻存，或计数后接种至微流控装置。
备注：为扩增细胞，每周传代1–2次，最大传代次数为13代。解离后在显微镜下观察，MABs呈圆形且体积较大。
3. 预组装微流控装置的制备——第9天
注意：本实验方案改编自微流控设备制造商的神经元设备操作指南，并已针对预组装设备和硅胶设备的使用进行了调整。本实验中，预组装设备用于免疫细胞化学（ICC）和活细胞钙瞬态记录，而硅胶设备则用于扫描电子显微镜（SEM）分析。本方案的时间线遵循运动神经元分化方案的时间安排。
- 在接种细胞的前一天准备微流控装置，因为包被需要过夜孵育。根据运动神经元实验方案，这一步应在星期三进行。向一个10 cm的培养皿中加入约10 mL的70%-100%乙醇。使用镊子将装置从运输容器中转移至培养皿中进行消毒。
- 将装置浸入乙醇中10秒，然后用镊子将其转移至一张纸上，在超净工作台中晾干约30分钟。翻转装置数次，确保两面均充分干燥。装置干燥后，使用镊子将每个装置转移至单独的10 cm培养皿中，以便后续操作。
注意：乙醇具有毒性，操作时应在通风橱内佩戴个人防护装备 - 用多聚-L-鸟氨酸（PLO）（100 µg/mL）在DPBS中对装置进行包被，并在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
- 使用P200移液器将100 µL含PLO的DPBS溶液加入上层孔中，尽量靠近通道开口处，观察液体从上层孔经通道流向底层孔。随后，向底层孔中加入100 µL含PLO的DPBS溶液。
- 在微沟槽的另一侧重复上述操作，最后在装置的一侧额外加入100 µL溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微沟槽（例如，右侧200 µL，左侧300 µL）。3小时后，用DPBS洗涤装置3次，每次5分钟。如有需要，可使用抽吸系统。
注意：在整个包被或细胞培养过程中，务必避免通道内产生气泡。即使微小气泡也会在短时间内膨胀，从而阻碍包被、细胞接种或培养基在通道中的流动。若在包被过程中液体在通道中停滞，应从两侧直接将PLO溶液重新注入通道。若仍有气泡存在，可用200 µL DPBS冲洗通道，并按照上述步骤3.3.1–3.3.2重复包被过程。若在细胞接种后出现气泡，则无法挽救该装置，因为冲洗通道会损伤细胞。
- 用层粘连蛋白（laminin）（20 µg/mL）在Neurobasal培养基中对装置进行包被，并在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。包被操作步骤与PLO包被的步骤3.3.1–3.3.2相同。
- 次日，使用P200移液器，将枪头置于与通道开口相对的孔中，移除孔中的层粘连蛋白包被液。向所有孔中加入DPBS，并将装置置于室温下的超净工作台中，保持含有DPBS的状态，以备细胞接种。
注意：从此时起，切勿直接从通道中移除液体（如层粘连蛋白包被液、DPBS、培养基、固定液等），因为这可能导致气泡形成。在接种细胞前，务必在显微镜下检查装置。
4. 微流控装置中神经前体细胞的接种 - 第10天
注意：根据运动神经元分化方案，第10天NPC的铺板应在星期四进行。
- 使用 freshly dissociated 的第10天NPCs，或每10 mL第10天运动神经元培养基（表2 和 表3）解冻1-2管冻存的NPCs，并加入ROCK抑制剂（10 µL/mL）溶液，以100 × g 离心4分钟。
- 将细胞沉淀重悬于500–1000 µL含ROCK抑制剂（10 µL/mL）的第10天运动神经元培养基中，采用任意常用计数方法计数活细胞。
注意： 如下所述，请确保将NPCs重悬于适量培养基中，以适应最佳接种体积。 - 使用P200移液器从装置微沟道一侧的两个孔中吸除DPBS，并在60–100 µL第10天运动神经元培养基中向每个装置接种250,000个NPCs。
- 在右上孔中，以45°角将30–50 µL细胞悬液（125,000个细胞）接种至靠近通道开口处，然后用移液器吸头轻轻将剩余液体沿孔底拖向孔中心。
- 暂停数秒，待细胞悬液流经通道后，在下方孔中重复此操作（30–50 µL，含125,000个细胞）。使用记号笔在接种侧标记“NPC”或等效标识，以便在不使用显微镜的情况下轻松识别装置方向。
- 将装置置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育5分钟，使细胞贴壁，随后向两个接种孔各补充第10天运动神经元培养基至总体积200 µL/孔，再次于37 °C、5% CO2 条件下孵育。
注意： 每孔最大容量为200 µL。在两个孔及通道中均接种细胞可形成更稳定的培养结构，降低换液过程中细胞脱落的风险。也可仅在通道中接种较少细胞，但此操作会使培养物在每次换液时更易受到通道内液体流动的影响。
- 使用P200移液器从微沟道另一侧、与新接种NPCs相对的两个孔中吸除DPBS，每孔加入200 µL第10天运动神经元培养基，并在上孔与下孔之间间隔数秒，使培养基流经通道。随后，在装置周围的10 cm培养皿中加入6 mL DPBS，以防止孵育过程中培养基蒸发。
注意： 在培养期间如需，可随时向装置周围补充DPBS。 - 在第11天（周五）、第14天（周一）和第16天（周三）对装置的两个腔室进行完全的运动神经元培养基更换（表2 和 表3）。在换液当天添加新鲜的培养基添加剂。
注意： 从此步骤开始，所有换液操作均使用P200移液器。移液器吸头应始终置于孔边缘、远离通道的位置，切勿直接从通道中吸液。操作时需小心，避免硅胶装置脱落。添加和移除培养基时应缓慢进行，以防细胞脱落。- 将P200移液器吸头置于通道开口对侧的孔壁底部边缘，小心吸除含NPCs的两个孔中的全部培养基。随后，将P200移液器吸头置于通道开口对侧的孔壁顶部边缘，缓慢向顶孔加入50–100 µL新鲜运动神经元培养基。
- 暂停数秒，待培养基流经通道后，向底孔加入50–100 µL运动神经元培养基。重复此操作直至两孔均达到200 µL/孔。在无细胞的一侧重复相同操作。
5. 微流控装置中MAB的铺板——第17天
- 在将MABs接种到微流控装置前约7天（运动神经元分化第10天），解冻MABs，并将其接种于经胶原蛋白包被的T75培养瓶中的生长培养基（表1）中，以实现充分的细胞扩增。参见第2节。
- 在运动神经元分化第17天（星期四），按照步骤2.4所述方法消化MABs，将细胞沉淀重悬于约500 µL生长培养基中，并使用任意常用的计数方法对活细胞进行计数。
注意： 如下所述，请确保将MABs重悬于适当体积的培养基中，以满足最佳接种体积的要求。 - 用P200移液器移除装置中微沟道未接种侧的运动神经元培养基，用DPBS轻轻洗涤，然后每装置接种200,000个MABs于60–100 µL生长培养基中。
- 在右上孔中，将30–50 µL细胞悬液（100,000个细胞）以45°角靠近通道开口处加入，然后用移液器吸头沿孔底轻轻将剩余液体拖向孔中心。暂停数秒，使细胞流入通道后，再在下方孔中重复此操作（30–50 µL中含100,000个细胞）。
- 将装置置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育5分钟，以促进细胞贴壁，随后向两个新接种MABs的孔中补充生长培养基至终体积200 µL/孔。再次置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
注意： 装置的运动神经元侧在第17天无需换液。根据先前发表的运动神经元分化方法，第17天的换液操作改在第18天（星期五）进行。
6. 建立体积梯度与化学趋化梯度以促进运动神经元神经突向MAB室生长
- 第18天，在运动神经元侧更换全部培养基，使用第18天运动神经元培养基（200 µL/孔）。遵循步骤4.5.1–4.5.2中所述的换液操作说明。在装置的MAB区域启动MAB分化（表2 和 表4）。
- 在加入预热的MAB分化培养基（表4）之前，先用DPBS小心清洗MAB区域一次，该培养基需添加0.01 µg/mL人源聚集蛋白（agrin）（200 µL/孔）。
注意：MAB细胞将在一周时间内融合并形成多核肌管。
- 在加入预热的MAB分化培养基（表4）之前，先用DPBS小心清洗MAB区域一次，该培养基需添加0.01 µg/mL人源聚集蛋白（agrin）（200 µL/孔）。
- 第21天，根据运动神经元分化方案（星期一），建立化学趋化与体积梯度（表2 和 表3）。
- 在肌管区域（先前定义为MAB区域）中每孔加入200 µL含以下成分的运动神经元基础培养基：30 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）、睫状神经营养因子（CNTF）、人源聚集蛋白（0.01 µg/mL）和层粘连蛋白（laminin，20 µg/mL）；在运动神经元区域每孔加入不含生长因子的运动神经元基础培养基（100 µL/孔）。
表1：MAB生长培养基。 该培养基在4 °C下可保存2周。bFGF需在使用当天新鲜添加。
| 试剂 | 储存浓度 | 终浓度 |
| IMDM | 1x | 80% |
| 胎牛血清 | 15% | |
| 青霉素/链霉素 | 5000 U/mL | 0.5% |
| L-谷氨酰胺 | 50x | 1% |
| 丙酮酸钠 | 100 mM | 1% |
| 非必需氨基酸 | 100x | 1% |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | 100x | 1% |
| bFGF（新鲜添加） | 50 μg/mL | 5 ng/mL |
表2：运动神经元基础培养基。 培养基在4 °C下可保存4周。
| 试剂 | 储存浓度 | 终浓度 |
| DMEM/F12 | 50% | |
| Neurobasal 培养基 | 50% | |
| 青霉素/链霉素 | 5000 U/mL | 1% |
| L-谷氨酰胺 | 50x | 0.5 % |
| N-2 添加剂 | 100x | 1% |
| 不含维生素 A 的 B-27 | 50x | 2% |
| β-巯基乙醇 | 50 mM | 0.1% |
| 抗坏血酸 | 200 μM | 0.5 μM |
表3：运动神经元培养基添加剂。 添加剂需在使用当天新鲜加入运动神经元基础培养基中。
| 天数 | 试剂 | 储存浓度 | 终浓度 | 作用部位 |
| 第10/11天 | Smoothened激动剂 | 10 mM | 500 nM | 两者 |
| 视黄酸 | 1 mM | 0.1 μM | ||
| DAPT | 100 mM | 10 μM | ||
| BDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| GDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| 第14天 | DAPT | 100 mM | 20 μM | 两者 |
| BDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| GDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| 第16天 | DAPT | 100 mM | 20 μM | 两者 |
| BDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| GDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| CNTF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| 第18天 | BDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | 运动神经元 |
| GDNF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| CNTF | 0.1 mg/mL | 10 ng/mL | ||
| 第21天及以后 | BDNF | 0.1 mg/mL | 30 ng/mL | 肌管 |
| GDNF | 0.1 mg/mL | 30 ng/mL | ||
| CNTF | 0.1 mg/mL | 30 ng/mL | ||
| Agrin | 50 μg/mL | 0.01 μg/mL | ||
| Laminin | 1 mg/mL | 20 μg/mL | ||
| 第21天及以后 | 无添加物 | 运动神经元 |
表4：MAB分化培养基。 培养基在4 °C下可保存2周。Agrin需在使用当天新鲜添加。
| 天数 | 试剂 | 储存浓度 | 终浓度 | 培养室 |
| 第18天 | DMEM/F12 | 97% | MAB | |
| 丙酮酸钠 | 100 mM | 1% | ||
| 马血清 | 2% | |||
| Agrin | 50 μg/mL | 0.01 μg/mL |
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结果
图1：微流控装置中运动单元实验方案的示意图。 根据运动神经元分化方案的时间线，展示从第0天到第28天的分化时间进程及共培养总体流程。在第0天启动由iPSCs向运动神经元的分化，并按先前所述方法继续培养10天。第9天对装置进行灭菌并用PLO-层粘连蛋白包被。同时解冻MABs并在T75培养瓶中扩增。第10天将运动神经元-NPCs接种至装置一个区室（浅灰色）的两个小室及通道中，并继续在此区室中诱导其向运动神经元分化一周。第17天将MABs接种至相对区室（深灰色）的两个小室及通道中。第18天开始诱导MABs向成肌管分化。第21天建立体积梯度与化学趋化梯度，以促进运动神经元的神经突通过装置中的微沟槽发生极化。运动神经元区室每孔加入100 µL不含生长因子的运动...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | 包被组分。H226，H314。P280 |
| Agrin（重组人蛋白） | R&D systems | 6624-AG-050 | 培养基添加剂 |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4403 | 培养基组分 |
| βIII-微管蛋白（Tubulin） | Abcam | ab7751 | 抗体（1:500） |
| β-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 培养基组分。H317。P280。 |
| B-27（不含维生素A） | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | 培养基组分 |
| BDNF（脑源性神经营养因子） | Peprotech | 450-02B | 生长因子 |
| bFGF（重组人碱性成纤维细胞生长因子） | Peprotech | 100-18B | 生长因子 |
| 小牛皮胶原蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | 包被组分 |
| CNTF（睫状神经营养因子） | Peprotech | 450-13B | 生长因子 |
| DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | 培养基添加剂 |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | 培养基组分 |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | 冷冻保存组分。H315，H319，H335。P280。 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | 无钙、无镁 |
| 乙醇 | VWR | 20.821.296 | 消毒。H225。P280 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | 培养基组分 |
| 荧光封片介质 | Dako | S3023 | 免疫细胞化学组分 |
| GDNF（胶质细胞系源性神经营养因子） | Peprotech | 450-10B | 生长因子 |
| 马血清 | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | 培养基组分 |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | 培养基组分 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | 培养基组分 |
| 无血清替代物（Knockout serum replacement） | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | 冷冻保存组分 |
| Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜层粘连蛋白 | Sigma | L2020-1MG | 包被组分及培养基添加剂 |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | 培养基组分 |
| N-2 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | 培养基组分 |
| Neurobasal 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | 包被及培养基组分 |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | 培养基组分 |
| Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | 储存用具 |
| 青霉素/链霉素（5000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | 培养基组分 |
| 培养皿（3 cm） | nunc | 153066 | 直径：3 cm |
| 培养皿（10 cm） | Sarstedt | 833.902 | 直径：10 cm |
| 培养板（6孔） | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | 培养板 |
| 多聚-L-鸟氨酸（PLO） | Sigma | P3655-100MG | 包被组分 |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | 培养基添加剂。H302，H315，H360FD，H410。P280。 |
| Revita 细胞添加剂 | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK 抑制剂溶液 |
| Smoothened 激动剂 | Merch Millipore | 566660 | 培养基添加剂 |
| 丙酮酸钠 | Life Technologies | 11360-070 | 培养基组分 |
| T75 培养瓶 | Sigma | CLS3276 | 培养板 |
| TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB 解离溶液 |
| 盐酸筒箭毒碱五水合物 | Sigma | T2379-100G | 乙酰胆碱受体阻断剂。H301。P280。 |
| XonaChips 预组装微流控装置 | Xona Microfluidics | XC150 | 微通道长度：150 μm |
