使用微流体设备生成神经肌肉接头

Abstract

来源:Stoklund Dittlau， K. et al.， 微流体设备中具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元的生成。J. Vis. Exp. （2021 年）

该视频演示了使用微流体设备形成神经肌肉接头的过程。神经前体细胞和肌肉祖细胞接种到设备内的不同孔中，并分别成熟为运动神经元和肌管。体积和化学梯度的产生导致活跃的神经肌肉接头的发展。

Protocol

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

本协议中使用的所有试剂和设备均列在材料表中，应无菌使用。除非另有说明，否则使用前应将培养基加热至室温 （RT）。有关共培养方案的概述，请参见图 1。

1. 运动神经元祖细胞与诱导多能干细胞 （iPSC） 的分化

1. 遵循改编自先前研究的运动神经元分化方案，直到达到第 10 天的神经祖细胞 （NPC） 状态。根据协议的时间框架，分化在星期一（第 0 天）开始，这导致星期四有第 10 天 NPC。
2. 用 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 以 2 x 10⁶- 4 x 10^{6 个}细胞的密度，每瓶 6 个细胞的基因敲除血清冷冻保存第 10 天 NPC。
   谨慎:DMSO 有毒:在装有个人防护设备的通风橱中处理><。 注意:预计每天大约 50% 的 10 个 NPC 在解冻时至关重要。在这种"第 10 天 NPC"状态下停止运动神经元分化方案，并冷冻保存 NPC 以产生大量 NPC，这些 NPC 可以储存并在以后使用，将共培养方案的整体时间线长度从 28 天缩短到 19 天总计。

Results

图 1:微流体设备中电机单元协议的示意图概述。根据运动神经元分化方案的时间表，从第 0 天到第 28 天的分化时间表和共培养概述。从 iPSC 的运动神经元分化在第 0 天开始，并在接下来的 10 天内如前所述进行。第 9 天，对设备进行消毒并涂有 PLO-层粘连蛋白。MAB 在 T75 培养瓶中解冻以扩增。在第 10 天，将运动神经元 NPC 接种在装置的一个隔室（浅灰色）的两个孔和通道中，在那里它们分化为运动神经元持续一周。在第 17 天，将 MAB 接种在两个孔和对面隔室（深灰色）的通道中。第 18 天，MABs 开始分化为肌管。在第 21 天，建立体积和趋化梯度以促进运动神经元 - 神经突极化通过装置的微槽。运动神经元隔室接受 100 μL/孔不含生长因子的运动神经元基础培养基（浅绿色隔室），而肌管隔室接受 200 μL/孔含 30 ng/mL 生长因子的运动神经元基础培养基（深绿色隔室）（

Materials