构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

摘要

来源：Tedesco, M.，等，将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新的体外实验模型。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用海马神经元构建三维神经元培养物并与平面微电极阵列耦合的方法。分离的神经元在微电极阵列的活性区域上形成二维网络，并附着于带有膜插件的多孔板中的玻璃微珠上。当将这些带有神经元的微珠转移至电极上时，它们会自组织成相互连接的三维神经网络。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 胚胎解剖与组织解离

1. 将成年雌性大鼠（200–250 g）饲养于动物房中，保持恒定温度（22 ± 1 °C）和相对湿度（50%），并采用规律的明暗周期（光照时间：上午7点至晚上7点）。确保食物和饮水自由获取。
2. 使用3%异氟烷对妊娠18天（E18）的雌性大鼠进行麻醉，随后通过颈椎脱位法处死动物。
3. 从每只大鼠胚胎中取出海马组织，并置于冰上预冷的无Ca²⁺和Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液中。在发育第18天，海马和皮层组织非常柔软，无需切割成小块。更多细节可参见相关文献。
4. 将组织置于含0.05% DNA酶的0.125%胰蛋白酶/Hank's溶液中，在37 °C下消化18–20分钟，以实现组织解离。
5. 用巴斯德吸管移除上清液，并加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基孵育5分钟，以终止酶消化反应。
6. 移除含FBS的培养基，用含补充成分（1% L-谷氨酰胺、10 µg/ml庆大霉素）的培养基洗涤一次。再次用巴斯德吸管移除培养基，然后重新加入少量（500 µl）含补充成分（1% L-谷氨酰胺、10 µg/ml庆大霉素）的生长培养基。
7. 使用细口巴斯德吸管通过机械吹打解离组织沉淀，直至形成乳白色细胞悬液。细胞悬液无需离心。
8. 用生长培养基稀释少量细胞悬液，使终体积为2.0 ml。使用血细胞计数板测定细胞浓度，并将该细胞悬液按1:5比例稀释，以获得目标细胞浓度（600–700 个细胞/µl）。

2. 细胞接种

1. 将细胞以约 2,000 个细胞/mm² 的密度接种到 MEA 的活性区域，该区域由 PDMS 限域结构界定，用于构建二维神经网络。
   注意： 每个海马体约含 5 × 10⁵ 个细胞（单个胚胎为 1 × 10⁶ 个细胞）。解剖 6 个胚胎，总共获得 6 × 10⁶ 个细胞于 2 ml 中，细胞浓度约为 3,000 个细胞/µl。将此浓度按 1:5 稀释，以获得所需细胞浓度，即约 600–700 个细胞/µl，并以此浓度接种。若 PDMS 限域结构界定的 MEA 区域约为 7.065 mm²，接种的总细胞数为 600 个细胞/µl × 24 µl = 14,400 个细胞，则最终密度为 2,038 个细胞/mm²。
2. 将 MEA 器件置于 37 °C、含加湿 CO₂ 环境（5%）的培养箱中。
3. 将约 160 µl 细胞浓度为 600–700 个细胞/µl 的细胞悬液（约 100,000 个细胞）分配至多孔板内微珠单层表面，以完成三维培养构建的初步步骤。将多孔板置于 37 °C、含加湿 CO₂ 环境（5%）的培养箱中。

3. 三维神经网络的构建

1. 铺板后6-8小时，使用移液器（设定体积约为30-40 µl）将悬浮液（含神经元的微珠）非常小心地转移至PDMS约束区域内的限定范围内。每次转移后，等待约半分钟，使微珠能够自组装成紧密的六边形结构。
2. 当所有层均已沉积并自发组装完成后，在PDMS约束区域的顶部补充一大滴培养基，体积约为300 µl。
3. 将与MEA结合的3D结构置于培养箱中（温度 = 37.0 °C，CO₂ = 5%），培养48小时后，加入终体积约1 ml的含补充物的生长培养基。
   注意：参考带膜插件的多孔板上的微珠总数（30,000个）以及单层MEA装置上的微珠数量（6,000个）。由此形成的3D结构由5层微珠和细胞组成。由于3D神经网络并非几何上完全规整，实际形成的3D结构可能包含5-8层。
4. 铺板次日，小心地向MEA环内加入终体积的培养基（约900 µl）。将3D培养物维持在湿度饱和、含5% CO₂的环境中，温度为37 °C，持续培养4-5周，每周更换一半培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
胰蛋白酶	Gibco	25050-014	0.125%，用不含钙和镁离子的HBSS按1:2稀释
脱氧核糖核酸酶	Sigma-Aldrich	D5025	0.05%，溶于Hanks溶液
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	培养基
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% 培养基添加剂
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/升
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Corning Sigma	481939	固化剂和聚合物
微电极阵列	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA参数：电极网格8×8；电极间距和直径分别为200和30 µm；带无螺纹塑料环
微珠	Distrilab-Duke Scientific	9040	1克 玻璃颗粒标准品 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	带膜插件的多孔板（孔径6.5 mm，孔径0.4 µm）
不含钙和镁离子的HBSS	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks缓冲液	Sigma	H8264
大鼠	Sprague Dawley	Wistar大鼠