构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

摘要

来源：Tedesco, M.，等，将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新的体外实验模型。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用海马神经元构建三维神经元培养物并与平面微电极阵列耦合的方法。分离的神经元在微电极阵列的活性区域上形成二维网络，并附着于带有膜插件的多孔板中的玻璃微珠上。当将这些带有神经元的微珠转移至电极上时，它们会自组织成相互连接的三维神经网络。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 胚胎解剖与组织解离

1. 将成年雌性大鼠（200–250 g）饲养于动物房中，保持恒定温度（22 ± 1 °C）和相对湿度（50%），并采用规律的明暗周期（光照时间：上午7点至晚上7点）。确保食物和饮水自由获取。
2. 使用3%异氟烷对妊娠18天（E18）的雌性大鼠进行麻醉，随后通过颈椎脱位法处死动物。
3. 从每只大鼠胚胎中取出海马组织，并置于冰上预冷的无Ca²⁺和Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液中。在发育第18天，海马和皮层组织非常柔软，无需切割成小块。更多细节可参见相关文献。
4. 将组织置于含0.05% DNA酶的0.125%胰蛋白酶/Hank's溶液中，在37 °C下消化18–20分钟，以实现组织解离。
5. 用巴斯德吸管移除上清液，并加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基孵育5分钟，以终止酶消化反应。
6. 移除含FBS的培养基，用含补充成分（1% L-谷氨酰胺、10 µg/ml庆大霉素）的培养基洗涤一次。再次用巴斯德吸管移除培养基，然后重新加入少量（500 µl）含补充成分（1% L-谷氨酰胺、10 µg/ml庆大霉素）的生长培养基。
7. 使用细口巴斯德吸管通过机械吹打解离组织沉淀，直至形成乳白色细胞悬液。细胞悬液无需离心。....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
胰蛋白酶	Gibco	25050-014	0.125%，用不含钙和镁离子的HBSS按1:2稀释
脱氧核糖核酸酶	Sigma-Aldrich	D5025	0.05%，溶于Hanks溶液
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	培养基
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% 培养基添加剂
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/升
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Corning Sigma	481939	固化剂和聚合物
微电极阵列	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA参数：电极网格8×8；电极间距和直径分别为200和30 µm；带无螺纹塑料环
微珠	Distrilab-Duke Scientific	9040	1克 玻璃颗粒标准品 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	带膜插件的多孔板（孔径6.5 mm，孔径0.4 µm）
不含钙和镁离子的HBSS	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks缓冲液	Sigma	H8264
大鼠	Sprague Dawley	Wistar大鼠