一种用于研究神经元-胶质细胞相互作用的间接神经元-星形胶质细胞共培养技术

摘要

来源：Gottschling, C. 等 间接神经元-星形胶质细胞共培养实验：一种 体外 神经元-胶质细胞相互作用精细研究的实验装置 视频实验杂志 (2016)

本视频展示了一种采用区室化方法建立间接神经元-星形胶质细胞共培养的技术。在此体系中，神经元与星形胶质细胞在空间上相互分离，但共享一种条件培养基。星形胶质细胞释放的神经营养因子可促进神经元分化及突触连接的形成，提示存在神经元-胶质细胞间的相互作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 皮层星形胶质细胞的制备与培养

注意：请在进行后续步骤前至少提前 7 天完成本方案的这些步骤，因为星形胶质细胞培养物需在神经元制备前形成融合的单层。原代星形胶质细胞来源于出生后第 0–3 天（P0–3）小鼠幼崽的混合胶质细胞培养物。每瓶 T75 培养瓶使用三只小鼠（6 个皮层）。

1. 在无菌条件下，通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10% v/v 马血清和0.1% v/v 庆大霉素配制星形胶质细胞培养基。将培养基于4 °C保存，最多可保存2周。
2. 用 10 µg/mL 的试剂包被 3 个 T75 培养瓶 聚-D-赖氨酸（PDL；溶于细胞培养级水）孵育至少1小时 在37 °C、6% v/v CO存在条件下₂包被后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤烧瓶两次，以去除未结合的阳离子，并加入9 mL 星形胶质细胞培养基
3. 脑组织制备时，加入10 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS）至 1x 10 cm 培养皿，加入 1 mL 将HBSS加入1个15 mL离心管中（无论使用脑组织的数量）。操作时，将一把手术剪、两把精细镊子和一台体视显微镜置于操作区域附近备用。
4. 用手术剪迅速将3只幼鼠断头，并将头部收集到一个空的10 cm培养皿中。
   1. 在双目镜下进行大脑皮层的制备。使用两把精细镊子，从颈部开始沿中线向上至眼部水平，剥离颅骨背侧的皮肤。随后即可在颅骨下观察到带有血管的大脑组织。
   2. 用镊子固定头部前端，从后端开始沿颅骨中线剪开。随后，剪除左右两侧颅骨，以暴露脑组织。
   3. 闭合镊子尖端，将其置于脑组织腹侧下方。将脑组织从颅骨中取出，并转移至盛有HBSS的10 cm培养皿中。以相同方法处理其余样本，直至所有脑组织均收集至培养皿中。
5. 收集脑组织后，使用一对镊子像使用剪刀一样夹住后脑部分，从而分离大脑皮层。用另一对镊子在两个半球之间沿中线做切口。用镊子小心固定脑组织，再用第二对镊子切除中脑和嗅球，最终获得两个皮层半球。
6. 用一对镊子固定一侧大脑半球，用另一把镊子从外侧边缘分离脑膜，然后从皮质表面将其剥离。
7. 将皮层半侧翻转，使其表面朝下贴近培养皿；用一把镊子仔细解剖并移除新月形的海马体。将单个皮层组织转移至锥形15 mL离心管中 使用一把闭合的镊子夹取单个皮质组织放入试管中。
8. 收集完所有皮层组织后，转移至无菌超净工作台，开始进行皮层组织解离的准备工作。
9. 加入 1 mL DMEM 至 2 mL 反应管中加入0.1%（w/v）木瓜蛋白酶（30单位）。将悬液置于37°C水浴中孵育，直至溶液变澄清（约3分钟）。加入0.24 mg/mL L-半胱氨酸和 20 µg/mL 加入DNA酶并轻轻振荡。
   注意：用于消化，约1 mL 需要酶溶液。
10. 经 0.22 µm 滤膜过滤，收集 1 mL 滤液 在将其加入皮质组织之前，先置于无菌溶液中。将试管孵育30分钟至1小时 37 °C下（即，置于水浴中）_.
    注意：步骤 1.11 - 1.14 至关重要，应在 15 分钟内完成。
11. 为终止消化反应，加入 1 mL 星形胶质细胞培养基，并使用1 mL移液器轻轻吹打消化后的组织 移液器。进行吹打时，轻柔地上下移动移液器的活塞，从而反复吸取和推出皮质组织悬液。
12. 组织解离成单细胞悬液后，加入 5 mL 星形胶质细胞培养基，216 × g 离心5分钟。
13. 小心吸去上清液，将沉淀物中的细胞重悬于 1 mL 液体中 星形胶质细胞培养基
14. 将细胞悬液加入已补充了9 mL星形胶质细胞培养基（见1.2）的T75培养瓶中。
15. 在37 °C、6% v/v CO₂的培养箱中孵育细胞₂4天后进行首次完全换液（10 mL），此后每2至3天更换一次培养基。
16. 7天后，检查细胞是否已形成融合的单层。若未达到完全融合，需再等待2至3天，直至培养物完全融合。
    注意星形胶质细胞呈现较大且扁平的细胞体，位于培养瓶底部，不形成明显的细胞突起。它们与位于上层的小型相位对比明亮的前体细胞和小胶质细胞不同 单层细胞。
17. 为了去除前体细胞并获得纯化的星形胶质细胞培养物，将T75培养瓶置于摇床上，于37 °C以250 rpm速度振荡过夜。确保培养瓶的滤膜用实验室封口膜密封，以防止CO₂培养箱中液体蒸发_2.
18. 次日，吸除培养基，加入10 mL新鲜培养基，补充20 µM 阿糖胞苷（cytosine-1-β-D-arabinofuranoside, AraC），以清除残留的增殖细胞。     
    注意：在37 °C培养箱中用AraC孵育2 - 3 d， 6% CO₂ 将获得纯化的星形胶质细胞培养物。
19. 通过光学显微镜下目视检查监测星形胶质细胞培养物的纯度。若在星形胶质细胞单层上仍残留有相位对比明亮的前体细胞和小胶质细胞 （参见步骤1.16），重复步骤1.18和1.19。
    注意：融合且纯化的星形胶质细胞单层可在培养箱中（37 °C，6% v/v CO₂）维持长达14天₂) 后再进行下一步操作。每3天更换一半培养基。不要收集、冷冻和解冻星形胶质细胞，因为这些细胞会通过冻存过程失去其对神经元的支持特性。

2. 星形胶质细胞间接共培养的准备

注意48 - 72 小时 在制备神经元之前，先将星形胶质细胞转移至细胞培养小室。通常，单个 T75 培养瓶可提供足够的细胞数量，以支持一次制备所获得的神经元培养。

1. 根据需要将多个插入式培养小室放入24孔板中。每孔小室用10 µg/mL多聚赖氨酸（PDL，溶于细胞培养级水中）在37 °C、6% v/v CO₂条件下包被约1小时。孵育后，用PBS洗涤小室两次。在此期间，可同时进行星形胶质细胞的制备。
   注意：加入PBS的插入式小室可保留，直至星形胶质细胞悬液准备就绪。
2. 吸除星形胶质细胞培养基（含AraC），并用10 mL PBS洗涤培养物一次，以确保去除任何残留血清。
3. 向培养瓶中加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），在37 °C、6% v/v CO₂ 条件下孵育约10分钟，进行细胞消化。
4. 在显微镜下通过目视检查细胞脱落情况，并通过轻敲培养瓶侧面以促进细胞脱落。
   注意：步骤2.5至2.8至关重要，应在15至20分钟内完成。
5. 消化完成后，将细胞轻轻重悬于7 mL星形胶质细胞培养基中，转移至15 mL离心管。以216 × g离心5分钟。
6. 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL星形胶质细胞培养基中。
7. 使用细胞计数板对细胞进行计数。
8. 向24孔板各孔底部加入500 µL星形胶质细胞培养基，并将25,000个细胞溶于500 µL培养基中接种至每个插入式小室。在37 °C、6% v/v CO₂条件下孵育培养物。 
   注意：培养42至72小时后 ，细胞将达约100%汇合。此时可通过免疫细胞化学法验证培养物纯度。汇合后的培养物可维持最多7天，直至进行下一步操作。每3天更换一半培养基。

3. 原代海马神经元的制备

注意：原代小鼠海马神经元应来源于定时妊娠小鼠的 E15.5 - E16 胚胎。

1. 制备神经元培养基（MEM，含10 mM丙酮酸钠，0.1% w/v卵清蛋白， 2% v/v B27 培养基添加剂，以及 0.1% v/v 庆大霉素（经无菌过滤）；制备培养基（HBSS 含 0.6% w/v 葡萄糖和 10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸））。将神经元培养基置于滤瓶中，于 37 °C、6% v/v CO₂ 条件下预温育并预平衡₂.
2. 将玻璃盖玻片（直径 12 mm）放入 24 孔板的孔中（使用专用于细胞培养小室的带缺口特殊盖玻片）。
   1. 至少孵育1小时，浓度为15 µg/mL 聚-DL-鸟氨酸水溶液（细胞培养级），37 °C 条件下使用。每孔至少加入 500 µL，确保完全覆盖盖玻片。用 PBS 洗涤孔板两次，洗涤后保留 PBS 至接种细胞前，防止孔板干燥。
3. 为分离海马体，准备3个直径10 cm的培养皿，每个培养皿中加入制备液，另准备1个2 mL离心管，内含1 mL制备液。准备好剪刀和两把精细镊子。
4. 通过颈椎脱位处死怀孕小鼠，用70%（v/v）乙醇清洗腹部进行消毒，然后用锋利的剪刀打开腹腔。小心剪下串珠状的子宫并转移至盛有1x制备液的10 cm培养皿中。
5. 接下来，将胚胎从子宫中取出。小心切开子宫，使用两把镊子小心剥离羊膜，避免损伤胚胎。随后，用剪刀将每只胚胎的头部剪下，并将头部分装转移至另一含有灌流液的10 cm培养皿中。
6. 按照1.4至1.7节所述方法进行头部样本的制备。
   1. 用一对镊子固定头部，在靠近后脑的颈部区域沿垂直于神经轴的方向切开颅骨和皮肤。用第二对镊子提起颅骨和皮肤 覆盖皮肤，并将柔软的颅顶向头部的吻端弯曲，从而暴露脑组织。
   2. 借助两把镊子，将脑组织从颅腔中分离。操作时，闭合其中一把镊子，从嗅球开始沿颅骨分离脑组织，并继续向后移动 向后脑方向收集脑组织，将脑放入另一含有制备液的10 cm培养皿中。
7. 按照上述星形胶质细胞制备方法（步骤1.6），从皮层部分分离海马组织。取出每个半球的海马并收集至装有制备液的2 mL离心管中。
8. 解剖完成后，将试管转移至无菌超净台，用含有木瓜蛋白酶的1 mL消化液消化海马组织。消化液的配制方法见步骤1.9–1.10，但需使用MEM替代DMEM。
   注意：步骤 3.9 - 3.12 至关重要，应在 10 - 15 分钟内完成。
9. 消化完成后，用移液管轻轻抽吸，小心吸出消化液。
10. 用神经元培养基清洗海马组织3次，每次清洗循环中依次加入1 mL新鲜培养基，然后小心吸除。不要离心细胞悬液。
11. 最后一步洗涤后，用1 mL神经元培养基小心地吹打组织。
12. 使用计数板对细胞进行计数，并将35,000个细胞接种于24孔板（步骤3.2中提及的培养板）的单个孔中，每孔加入500 µL神经元培养基。
    注意可选地，可用台盼蓝对细胞等分试样进行复染，以评估细胞制备物的活力。通过显微镜目视检查控制铺板密度（通常使用标准10倍物镜时，每个视野90–110个细胞）。
13. 将神经元置于37 °C、6% v/v CO₂的培养箱中₂ 1小时。
14. 孵育结束后，将已准备好的细胞小室（接种有融合星形胶质细胞单层）从培养箱中取出（参见步骤2.8）。通过吸除星形胶质细胞培养基，并替换为500 µl新鲜的神经元培养基，更换培养液。
    注意：插入物在培养 2 - 3 天后应形成汇合的星形胶质细胞单层（DIV，培养天数） 体外).
15. 使用无菌镊子小心地将含有星形胶质细胞的插入物放入含有神经元培养物的孔中（步骤 3.13）。
16. 将获得的间接神经元-星形胶质细胞共培养物放回37 °C、6% v/v CO₂的培养箱中₂.
    注意在这些条件下，神经元可在完全定义的培养基中培养长达4周，无需更换培养基。对于长期培养，建议在空孔中加入无菌水，以减少24孔板中的蒸发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
B27	Gibco（Life Technologies）	17504-044
细胞培养级水	MilliQ
细胞培养级水	MilliQ
阿糖胞苷（Cytosine-ß-D arabinofuranoside, AraC）	Sigma-Aldrich	C1768	警告：H317，H361
DMEM	Gibco（Life Technologies）	41966-029
DNA酶	沃辛顿	LS002007
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1397	警告：H317-334
葡萄糖	Serva	22700
HBSS	Gibco（Life Technologies）	14170-088
HEPES	Gibco（Life Technologies）	15630-056
马血清	Biochrom AG	S9135
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco（Life Technologies）	31095-029
卵清蛋白	Sigma-Aldrich	A7641	警告：H334
木瓜蛋白酶	Worthington	3126
PBS	自制
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	S8636
胰蛋白酶-EDTA	Gibco（Life Technologies）	25300054
仪器设备
24孔板	Thermo Scientific/Nunc	142475
24孔板（用于  间接共培养	BD Falcon	353504
双目	Leica	MZ6
细胞培养小室	BD Falcon	353095
离心	Heraeus	Multifuge 3S-R
计数室	Marienfeld	650010
镊子	FST Dumont（#5）	11254-20
玻璃盖玻片（12 mm）	卡尔·罗思（门泽尔-格拉泽）	P231.1
培养箱	赛默飞世尔科技	Heracell 240i
微量离心管（2 ml）	Sarstedt	72,691
显微镜	Leica	DMIL
Millex 注射器驱动滤器单元	Millipore	SLGV013SL
轨道摇床	新不伦瑞克科学仪器公司	Innova 4000
Parafilm	贝米斯	PM-996
培养皿（10 cm）	Sarstedt	8,33,902
移液器（1 ml）	Gilson	Pipetman 1000
无菌工作台	The Baker 公司	层流无菌洁净台 SterilGARD III
手术剪刀	FST Dumont	14094-11
注射器	Henry Schein	9003016
T75 培养瓶	Sarstedt	83,39,11,002
管（15 ml）	Sarstedt	6,45,54,502
水浴锅	GFL	水浴锅型号1004