一种分离和培养小鼠星形胶质细胞的简易技术

摘要

来源：Wolfes, A. C., 等., 使用快速、简单且经济的AWESAM方案培养具有体内特性的鼠星形胶质细胞。J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了一种从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的简单方法。在培养过程中，通过使用星形胶质细胞特异性培养基并抑制非星形胶质细胞的贴壁，该方法可选择性地培养星形胶质细胞。这些培养的星形胶质细胞呈现星状形态，并具有细长的突起。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 大鼠或小鼠脑解剖

注意：小鼠和大鼠均可使用。也可使用出生8天以上的动物（我们测试至出生12天），但脑膜的去除将变得越来越困难。此外，细胞得率和活力会下降，因为较年长动物的脑细胞已形成复杂的突起和连接，在组织解离过程中容易断裂，导致细胞死亡增加。本文描述的是大脑皮层的制备方法，但其他脑区也可使用。

1. 将0.05%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中。
2. 通过缓慢升高CO2浓度处死动物（用于获取E19仔鼠的妊娠大鼠，或P0-P8阶段的动物）₂ 浓度，并分离脑组织。以下步骤需采用无菌操作技术。
3. 若使用胚胎组织，首先从子宫中取出胚胎并打开胚囊，然后立即用剪刀剪下头部。待所有头部切除后，立即将其转移至预冷的解剖液中。
   1. 将头部浸入培养基后，用镊子切开皮肤和颅骨（幼年动物的皮肤和颅骨均较柔软），并夹除小脑。小心将余下的脑组织从颅腔中撬起并取出。
      注意： E19 胚胎 2 至 4 只可获得足够组织，用于在解剖当天接种至少 8 个 10 cm 培养皿的皮层星形胶质细胞，每皿细胞密度为 500,000 个。
4. 对于新生或较大的幼鼠，使用剪刀剪下头部，并从后脑至鼻尖沿中线直线剪开皮肤以分离脑组织。将皮肤拨开，小心地左右剪开颅骨，然后掀起颅骨。切除小脑，再将剩余的脑组织撬起并取出。
   注意： 2至3只P0-P8阶段的幼鼠可提供足够的组织，用于在解剖当天接种至少八块10 cm培养皿的皮层星形胶质细胞，每皿接种500,000个细胞。
5. 将大脑皮层与下方的中脑结构分离。将镊子插入两半球之间的纵裂，然后将镊子沿与纵裂垂直的方向插入一侧半球的皮层与中脑结构之间，夹取并分离每个半球。
6. 使用镊子去除每个半球（及其海马）的所有脑膜，然后分离海马。如需海马星形胶质细胞，将每个海马转移至预冷的含有14 mL解剖液的15 mL离心管中。
7. 如果需要特定区域，可从每个半球的皮层中进一步去除其他部分（例如，额叶皮层）。将用于生成星形胶质细胞的任何皮层组织切成不超过1 mm³的组织块。将所有皮层组织块收集至另一支预冷的含解剖用培养基的15 mL离心管中，置于冰上。

2. 组织消化与解离

1. 收集完所有组织块后，等待其沉降至管底，然后尽可能吸除上清培养基。
2. 使用刻度移液管加入 2–3 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并将试管置于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。
   注意： 应迅速将胰蛋白酶-EDTA从移液管中释放，以混匀组织块，随后再次让组织块沉降。
3. 小心吸除胰蛋白酶-EDTA，尽量减少残留液体，使组织块保留在管底。
4. 加入 5 mL 预冷的解剖培养基以去除残留的胰蛋白酶-EDTA。将移液管插入管子上部侧面进行吹打，以混匀组织块。
5. 吸除解剖培养基，尽量减少残留液体。用预冷的解剖培养基重复此洗涤步骤两次。
6. 最后一次洗涤后，使用 1,000 µL 移液枪头加入 1 mL 已恢复至室温的 DMEM+，通过上下吹打重悬组织，注意避免产生气泡。
   注意： 必须避免产生气泡，因为这可能改变溶液的 pH 值，而星形胶质细胞对此非常敏感。
7. 将一个孔径为 100 µm 的细胞滤筛置于 50 mL 管口，并用 4.5 mL 预冷的 DMEM+ 预先润湿滤膜。
8. 将 1 mL 解离后的组织悬液通过移液方式加入细胞滤筛，并再加入 4.5 mL 预冷的 DMEM+，以冲洗细胞穿过滤筛。

3. 细胞传代

1. 传代前一天，用0.04% PEI包被细胞培养板。
2. 第0天 体外 解剖后第7天，将含有细胞的10 cm培养皿置于含DMEM+的培养箱内摇床中，以110 rpm振荡6小时。
3. 用去离子蒸馏水冲洗包被的盖玻片两次，去除PEI。向孔板中加入NB+H培养基（24孔板每孔500 µL，6孔板每孔2 mL）。将孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中预平衡。₂ 同时，将10 cm培养皿摇动至少30分钟。
4. 在6小时振荡结束前20-30分钟，将1×PBS、DMEM+、NB+H和0.25%胰蛋白酶-EDTA置于水浴中预热至37 °C。
5. 摇动6小时后，从摇床上取下培养皿，并立即用每皿10 mL预热的1×PBS更换培养基（其中含有脱落的神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞）。
   注意： 立即吸除含有脱落细胞的旧培养基，以防止非星形胶质细胞重新贴壁。
6. 吸除 PBS，每皿加入 3 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA。将每皿置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 4 分钟。₂
7. 向每皿3 mL胰蛋白酶-EDTA中加入5 mL预热的DMEM+，用5 mL血清移液管吹打使细胞脱离培养皿，并将细胞悬液收集至50 mL离心管中。
   注意： 从培养皿底部直接吸取——随着细胞脱落，培养皿底部应变得更为清晰。仅使用含血清的培养基（替代 DMEM+），因为血清可使胰蛋白酶失活。
8. 将细胞悬液在20 °C下以3,220 × g离心4分钟。
9. 移除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL预热的NB+H中。

4. 星形胶质细胞终末培养的细胞接种

1. 计数细胞。
2. 将20,000个细胞接种至6孔板的每个孔中（每孔加入2 mL NB+H培养基），或将5,000个细胞接种至24孔板的每个孔中（每孔加入500 µL NB+H培养基）。
3. 将细胞培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，直至进行后续处理或分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300054	使用前于 37  ºC 水浴中预热
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056	使用前于 37 ºC 水浴中预热
B-27 添加剂	Gibco	17504-044	50X 储存液
Glutamax	Gibco	35050-061	100X 储存液
青霉素/链霉素	Gibco	15070-063	50X 储存液；青霉素：5000 U/mL；链霉素：5000 µg/mL
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	不含 L-谷氨酰胺
DMEM	Gibco	41966029
HBEGF	Sigma	4643
HEPES	Gibco	15630080
HBSS	Gibco	14170112
FCS	Gibco	10437028
PBS	Gibco	10010049	1X
100 μm 尼龙细胞滤网	BD	352360
台盼蓝	Sigma	T8154
细胞培养孵育箱	Thermo Fisher Scientific	Hera Cell 240i cell culture incubator
实验室摇床	Heidolph	Rotamax 120	置于细胞培养孵育箱内使用
离心机	Eppendorf	5810 R