在微电极阵列上将人诱导多能干细胞分化为神经元

摘要

来源：Frega, M.，等，用于在微电极阵列上测量网络活性的诱导性多能干细胞的快速神经元分化。J. Vis. Exp. (2017)

该视频展示了一种从人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成兴奋性皮层神经元的方法。在多西环素诱导下，hiPSCs 过表达神经基因2（neurogenin-2），即一种神经特异性转录因子。通过使用特定培养基并结合星形胶质细胞共培养，该过程可促进 hiPSCs 分化为具有突触连接的神经元。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 在6孔MEA和玻璃盖玻片上将rtTA/Ngn2阳性hiPSCs分化为神经元

注意： 在此方案中，提供了用于分化的详细步骤 rtTA/Ngn2在两种不同基质上的阳性hiPSCs， 即 6孔MEA（每孔含有9个记录电极和1个参考电极的6个独立孔）以及24孔板中孔内的玻璃盖玻片。然而，这些方案可轻松调整用于更大的基底例如，根据表面积按比例放大所述数值，适用于12孔或6孔板的孔。

1. 准备多电极阵列（MEAs）或玻璃盖玻片（第0天和第1天）
   1. 在诱导分化开始的前一天，根据制造商的建议对MEAs进行灭菌处理。
   2. 将黏附蛋白聚-L-鸟氨酸（PLO）用无菌超纯水稀释至终浓度为50 µg/mL。通过在每个6孔MEA孔中加入100 µL稀释后的PLO液滴，覆盖其活性电极区域。使用无菌镊子将盖玻片放入24孔板的孔中，每孔加入800 µL稀释后的PLO。用1000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
   3. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育....

结果

图1：hiPSC向神经元的分化。A. hiPSC在盖玻片上向神经元分化的三个时间点。B. hiPSC在微电极阵列（MEAs）上的接种。C. T75培养瓶中达到100%融合度的星形胶质细胞（注意细胞形成镶嵌状单层）。比例尺：150 µm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27 添加剂	Gibco	0080085SA
无 Ca²⁺/Mg²⁺ HBSS	Gibco	14175-095
0.05 % 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
2.5 % 胰蛋白酶	Gibco	15090-046
高糖 DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
70 µm 细胞滤筛	BD Falcon	352350
DPBS	Gibco	14190-094
基底膜基质	Gibco	A1413201
DMEM/F12	Gibco	11320-074
细胞解离液	Sigma-Aldrich	A6964
E8 培养基	Gibco	A1517001
ROCK 抑制剂	Gibco	A2644501	也可使用如噻唑维林（thiazovivin）等其他 ROCK 抑制剂。
6 孔微电极阵列板（MEAs）	Multi Channel Systems	60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
玻璃盖玻片	VWR	631-0899
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P3655-10MG
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
强力霉素	Sigma-Aldrich	D9891-5G
N-2 添加剂	Gibco	17502-048
非必需氨基酸	Sigma-Aldrich	M7145
NT-3，人重组	Promokine	C66425
BDNF，人重组	Promokine	C66212
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
神经基础培养基	Gibco	21103-049
阿糖胞苷（Cytosine β-D-arabinofuranoside）	Sigma-Aldrich	C1768-100MG