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所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。
1. 在6孔MEA和玻璃盖玻片上将rtTA/Ngn2阳性hiPSCs分化为神经元
注意： 在此方案中，提供了用于分化的详细步骤 rtTA/Ngn2在两种不同基质上的阳性hiPSCs， 即 6孔MEA（每孔含有9个记录电极和1个参考电极的6个独立孔）以及24孔板中孔内的玻璃盖玻片。然而，这些方案可轻松调整用于更大的基底例如，根据表面积按比例放大所述数值，适用于12孔或6孔板的孔。
- 准备多电极阵列（MEAs）或玻璃盖玻片（第0天和第1天）
- 在诱导分化开始的前一天，根据制造商的建议对MEAs进行灭菌处理。
- 将黏附蛋白聚-L-鸟氨酸（PLO）用无菌超纯水稀释至终浓度为50 µg/mL。通过在每个6孔MEA孔中加入100 µL稀释后的PLO液滴，覆盖其活性电极区域。使用无菌镊子将盖玻片放入24孔板的孔中，每孔加入800 µL稀释后的PLO。用1000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
- 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。次日，吸除稀释的PLO，并用无菌超纯水清洗6孔MEA的玻璃表面和盖玻片各两次。
- 将层粘连蛋白（laminin）用冷的DMEM/F12培养基稀释至终浓度为20 µg/mL（用于6孔MEA）和10 µg/mL（用于玻璃盖玻片）。立即在每个6孔MEA孔的活性电极区域加入100 µL稀释后的层粘连蛋白液滴进行包被。同样，在24孔板的每个孔中加入400 µL稀释后的层粘连蛋白以包被盖玻片。用1,000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
- 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中孵育至少2小时。
- 接种hiPSCs（第1天）
注意： 步骤3.2.1至3.2.4中提到的体积假设rtTA/Ngn2-阳性hiPSCs在6孔板中培养，并且收获一个孔的细胞。接种细胞至6孔MEA和/或盖玻片所需的体积取决于实验中使用的6孔MEA数量和/或盖玻片数量；步骤3.2.6至3.2.8中提供的数值可用于不同规模实验的按比例调整。
- 将DMEM/F12、CDS和含1%（v/v）青霉素/链霉素的E8培养基恢复至室温。向E8培养基中加入强力霉素至终浓度为4 µg/mL，并加入ROCK抑制剂。
- 吸除rtTA/Ngn2-阳性hiPSCs的旧培养基，向细胞中加入1 mL CDS。在含5% CO2的湿润37 °C培养箱中孵育3–5分钟。在显微镜下检查细胞是否彼此分离。
- 向孔中加入2 mL DMEM/F12，用1,000 µL移液器轻轻吹打悬浮细胞，并将细胞转移至15 mL离心管中。向细胞悬液中再加入7 mL DMEM/F12。在200 × g条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，加入2 mL预配的E8培养基。用1,000 µL移液器枪头抵住15 mL离心管内壁，轻轻吹打重悬细胞以解离细胞团块。在显微镜下检查细胞是否已充分解离。
- 使用血细胞计数板测定细胞浓度（细胞/mL）。
注意： 一个6孔板孔在80–90%汇合度时通常可收获总计3.0–4.0 × 106个细胞。
- 吸除稀释的层粘连蛋白。对于6孔MEA，将细胞稀释至7.5 × 105 个细胞/mL的细胞悬液浓度，然后在每个6孔MEA孔的活性电极区域加入100 µL细胞悬液。对于盖玻片，将细胞稀释至4.0 × 104 个细胞/mL的细胞悬液浓度，然后向24孔板的每个孔中加入500 µL细胞悬液。
注意： MEAs上的最终细胞密度高于盖玻片上的密度（图1A和B）。我们发现，较高的细胞密度对于准确记录神经网络活动至关重要。本方案中提供的数值是针对检测需求优化后的结果。
- 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中孵育2小时（MEA）或过夜（24孔板）。
- 2小时后，向每个6孔MEA孔中小心加入500 µL预配的E8培养基。将6孔MEA置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
- 更换培养基（第2天）
- 次日，配制含1%（v/v）N-2补充剂、1%（v/v）非必需氨基酸和1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。加入人重组神经营养因子-3（NT-3）至终浓度10 ng/mL，人重组脑源性神经营养因子（BDNF）至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。将培养基预热至37 °C。
- 向上述培养基中加入层粘连蛋白至终浓度0.2 µg/mL。过滤所得培养基。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
- 添加大鼠星形胶质细胞（第3天）
注意： 本方案中提及的体积假设大鼠星形胶质细胞在T75培养瓶中培养。所添加的大鼠星形胶质细胞质量必须良好。我们采用两个标准评估大鼠星形胶质细胞的质量：第一，从大鼠胚胎脑组织分离后，星形胶质细胞培养应在十天内达到完全汇合；第二，传代后，大鼠星形胶质细胞应能形成致密、呈镶嵌状的单层（图1C）。若大鼠星形胶质细胞培养不符合这两个标准，建议不要用于分化实验。
- 将0.05%胰蛋白酶-EDTA恢复至室温。将DPBS和含1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12预热至37 °C。
- 吸除大鼠星形胶质细胞培养的旧培养基。加入5 mL DPBS轻轻晃动清洗细胞。
- 吸除DPBS，加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，轻轻晃动使其均匀分布。在含5% CO2的湿润37 °C培养箱中孵育5–10分钟。
- 在显微镜下检查细胞是否已脱落。通过轻敲培养瓶数次使残留细胞脱落。
- 向培养瓶中加入5 mL DMEM/F12。用10 mL移液器在瓶内轻轻吹打细胞。将细胞悬液收集至15 mL离心管中。在200 × g条件下离心8分钟。
- 吸除上清液，用1 mL DMEM/F12重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度（细胞/mL）。
- 向每个6孔MEA孔中加入7.5 × 104个星形胶质细胞。向每个24孔板孔中加入2.0 × 104个星形胶质细胞。将MEA和24孔板置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
- 更换培养基（第4天）
- 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。此外，加入阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside）至终浓度2 µM。
注意： 阿糖胞苷用于抑制星形胶质细胞增殖，并清除未向神经元分化的残留hiPSCs。
- 过滤培养基并预热至37 °C。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板继续置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中培养。
- 更换培养基（第6–28天）
注意： 从第6天开始，每隔两天更换一半培养基。从第10天起，培养基中需添加胎牛血清（FBS）以维持星形胶质细胞的存活。
- 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。从第10天起，还需在培养基中补充2.5%（v/v）FBS。过滤所得培养基并预热至37 °C。
- 使用1000 µL移液器从6孔MEA和24孔板各孔中移除一半旧培养基，替换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板继续置于含5% CO2的湿润37 °C培养箱中培养。
