在微电极阵列上将人诱导多能干细胞分化为神经元

摘要

来源：Frega, M.，等，用于在微电极阵列上测量网络活性的诱导性多能干细胞的快速神经元分化。J. Vis. Exp. (2017)

该视频展示了一种从人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成兴奋性皮层神经元的方法。在多西环素诱导下，hiPSCs 过表达神经基因2（neurogenin-2），即一种神经特异性转录因子。通过使用特定培养基并结合星形胶质细胞共培养，该过程可促进 hiPSCs 分化为具有突触连接的神经元。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 在6孔MEA和玻璃盖玻片上将rtTA/Ngn2阳性hiPSCs分化为神经元

注意： 在此方案中，提供了用于分化的详细步骤 rtTA/Ngn2在两种不同基质上的阳性hiPSCs， 即 6孔MEA（每孔含有9个记录电极和1个参考电极的6个独立孔）以及24孔板中孔内的玻璃盖玻片。然而，这些方案可轻松调整用于更大的基底例如，根据表面积按比例放大所述数值，适用于12孔或6孔板的孔。

1. 准备多电极阵列（MEAs）或玻璃盖玻片（第0天和第1天）
   1. 在诱导分化开始的前一天，根据制造商的建议对MEAs进行灭菌处理。
   2. 将黏附蛋白聚-L-鸟氨酸（PLO）用无菌超纯水稀释至终浓度为50 µg/mL。通过在每个6孔MEA孔中加入100 µL稀释后的PLO液滴，覆盖其活性电极区域。使用无菌镊子将盖玻片放入24孔板的孔中，每孔加入800 µL稀释后的PLO。用1000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
   3. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。次日，吸除稀释的PLO，并用无菌超纯水清洗6孔MEA的玻璃表面和盖玻片各两次。
   4. 将层粘连蛋白（laminin）用冷的DMEM/F12培养基稀释至终浓度为20 µg/mL（用于6孔MEA）和10 µg/mL（用于玻璃盖玻片）。立即在每个6孔MEA孔的活性电极区域加入100 µL稀释后的层粘连蛋白液滴进行包被。同样，在24孔板的每个孔中加入400 µL稀释后的层粘连蛋白以包被盖玻片。用1,000 µL移液枪头轻压盖玻片，防止其漂浮。
   5. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育至少2小时。
2. 接种hiPSCs（第1天）
   注意： 步骤3.2.1至3.2.4中提到的体积假设rtTA/Ngn2-阳性hiPSCs在6孔板中培养，并且收获一个孔的细胞。接种细胞至6孔MEA和/或盖玻片所需的体积取决于实验中使用的6孔MEA数量和/或盖玻片数量；步骤3.2.6至3.2.8中提供的数值可用于不同规模实验的按比例调整。
   1. 将DMEM/F12、CDS和含1%（v/v）青霉素/链霉素的E8培养基恢复至室温。向E8培养基中加入强力霉素至终浓度为4 µg/mL，并加入ROCK抑制剂。
   2. 吸除rtTA/Ngn2-阳性hiPSCs的旧培养基，向细胞中加入1 mL CDS。在含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育3–5分钟。在显微镜下检查细胞是否彼此分离。
   3. 向孔中加入2 mL DMEM/F12，用1,000 µL移液器轻轻吹打悬浮细胞，并将细胞转移至15 mL离心管中。向细胞悬液中再加入7 mL DMEM/F12。在200 × g条件下离心5分钟。
   4. 吸除上清液，加入2 mL预配的E8培养基。用1,000 µL移液器枪头抵住15 mL离心管内壁，轻轻吹打重悬细胞以解离细胞团块。在显微镜下检查细胞是否已充分解离。
   5. 使用血细胞计数板测定细胞浓度（细胞/mL）。
      注意： 一个6孔板孔在80–90%汇合度时通常可收获总计3.0–4.0 × 10⁶个细胞。
   6. 吸除稀释的层粘连蛋白。对于6孔MEA，将细胞稀释至7.5 × 10⁵ 个细胞/mL的细胞悬液浓度，然后在每个6孔MEA孔的活性电极区域加入100 µL细胞悬液。对于盖玻片，将细胞稀释至4.0 × 10⁴ 个细胞/mL的细胞悬液浓度，然后向24孔板的每个孔中加入500 µL细胞悬液。
      注意： MEAs上的最终细胞密度高于盖玻片上的密度（图1A和B）。我们发现，较高的细胞密度对于准确记录神经网络活动至关重要。本方案中提供的数值是针对检测需求优化后的结果。
   7. 将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育2小时（MEA）或过夜（24孔板）。
   8. 2小时后，向每个6孔MEA孔中小心加入500 µL预配的E8培养基。将6孔MEA置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
3. 更换培养基（第2天）
   1. 次日，配制含1%（v/v）N-2补充剂、1%（v/v）非必需氨基酸和1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。加入人重组神经营养因子-3（NT-3）至终浓度10 ng/mL，人重组脑源性神经营养因子（BDNF）至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。将培养基预热至37 °C。
   2. 向上述培养基中加入层粘连蛋白至终浓度0.2 µg/mL。过滤所得培养基。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
4. 添加大鼠星形胶质细胞（第3天）
   注意： 本方案中提及的体积假设大鼠星形胶质细胞在T75培养瓶中培养。所添加的大鼠星形胶质细胞质量必须良好。我们采用两个标准评估大鼠星形胶质细胞的质量：第一，从大鼠胚胎脑组织分离后，星形胶质细胞培养应在十天内达到完全汇合；第二，传代后，大鼠星形胶质细胞应能形成致密、呈镶嵌状的单层（图1C）。若大鼠星形胶质细胞培养不符合这两个标准，建议不要用于分化实验。
   1. 将0.05%胰蛋白酶-EDTA恢复至室温。将DPBS和含1%（v/v）青霉素/链霉素的DMEM/F12预热至37 °C。
   2. 吸除大鼠星形胶质细胞培养的旧培养基。加入5 mL DPBS轻轻晃动清洗细胞。
   3. 吸除DPBS，加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，轻轻晃动使其均匀分布。在含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中孵育5–10分钟。
   4. 在显微镜下检查细胞是否已脱落。通过轻敲培养瓶数次使残留细胞脱落。
   5. 向培养瓶中加入5 mL DMEM/F12。用10 mL移液器在瓶内轻轻吹打细胞。将细胞悬液收集至15 mL离心管中。在200 × g条件下离心8分钟。
   6. 吸除上清液，用1 mL DMEM/F12重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度（细胞/mL）。
   7. 向每个6孔MEA孔中加入7.5 × 10⁴个星形胶质细胞。向每个24孔板孔中加入2.0 × 10⁴个星形胶质细胞。将MEA和24孔板置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中过夜孵育。
5. 更换培养基（第4天）
   1. 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。此外，加入阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside）至终浓度2 µM。
      ​注意： 阿糖胞苷用于抑制星形胶质细胞增殖，并清除未向神经元分化的残留hiPSCs。
   2. 过滤培养基并预热至37 °C。吸除6孔MEA和24孔板各孔中的旧培养基，更换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板继续置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中培养。
6. 更换培养基（第6–28天）
   注意： 从第6天开始，每隔两天更换一半培养基。从第10天起，培养基中需添加胎牛血清（FBS）以维持星形胶质细胞的存活。
   1. 配制含2%（v/v）B-27补充剂、1%（v/v）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1%（v/v）青霉素/链霉素的Neurobasal培养基。加入NT-3至终浓度10 ng/mL，BDNF至终浓度10 ng/mL，以及强力霉素至终浓度4 µg/mL。从第10天起，还需在培养基中补充2.5%（v/v）FBS。过滤所得培养基并预热至37 °C。
   2. 使用1000 µL移液器从6孔MEA和24孔板各孔中移除一半旧培养基，替换为新配制的培养基。将6孔MEA和24孔板继续置于含5% CO₂的湿润37 °C培养箱中培养。

结果

图1：hiPSC向神经元的分化。A. hiPSC在盖玻片上向神经元分化的三个时间点。B. hiPSC在微电极阵列（MEAs）上的接种。C. T75培养瓶中达到100%融合度的星形胶质细胞（注意细胞形成镶嵌状单层）。比例尺：150 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27 添加剂	Gibco	0080085SA
无 Ca²⁺/Mg²⁺ HBSS	Gibco	14175-095
0.05 % 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
2.5 % 胰蛋白酶	Gibco	15090-046
高糖 DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
70 µm 细胞滤筛	BD Falcon	352350
DPBS	Gibco	14190-094
基底膜基质	Gibco	A1413201
DMEM/F12	Gibco	11320-074
细胞解离液	Sigma-Aldrich	A6964
E8 培养基	Gibco	A1517001
ROCK 抑制剂	Gibco	A2644501	也可使用如噻唑维林（thiazovivin）等其他 ROCK 抑制剂。
6 孔微电极阵列板（MEAs）	Multi Channel Systems	60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
玻璃盖玻片	VWR	631-0899
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P3655-10MG
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
强力霉素	Sigma-Aldrich	D9891-5G
N-2 添加剂	Gibco	17502-048
非必需氨基酸	Sigma-Aldrich	M7145
NT-3，人重组	Promokine	C66425
BDNF，人重组	Promokine	C66212
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
神经基础培养基	Gibco	21103-049
阿糖胞苷（Cytosine β-D-arabinofuranoside）	Sigma-Aldrich	C1768-100MG