使用悬滴培养技术制备神经元球

摘要

来源：Parvin, S. 等，利用突触前结构组织微珠与“神经元球”培养法进行突触前结构形成检测 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用悬滴培养技术生成神经元球的过程。在悬滴中，细胞向底部移动并自组装成三维结构，形成神经元球，可用于神经生物学研究。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 神经元球的制备（悬滴培养法）（体外培养第 in vitro (DIV) 0-3天）

注意：此处所述神经元球培养的制备步骤基于Sasaki团队先前报道的方法并进行了部分修改。我们还采用了Banker方法中用于解离培养的若干步骤。

1. 开始解剖前确认以下事项
   1. 提前准备好所有所需溶液，并通过高压灭菌或过滤法进行灭菌。
   2. 准备好皮层神经元培养各步骤中将使用的所有器械和材料。
   3. 用70%乙醇喷洒并擦拭超净工作台、解剖台、体视显微镜载物台、剪刀和镊子。
2. 通过应用CO₂ 处死小鼠，解剖腹部以获取E16胚胎。
3. 借助精细镊尖小心地从胚胎中取出脑组织，并转移至含有4 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐溶液（HBSS）的60 mm细胞培养皿中。
   注意：解剖用HBSS培养基包含10 mM HEPES（pH 7.4）、140 mM氯化钠（NaCl）、5.4 mM氯化钾（KCl）、1.09 mM磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、1.1 mM磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、5.6 mM D-葡萄糖和5.64 µM酚红。
4. 去除头皮，切除嗅球，在体视显微镜下用精细镊尖将每个大脑半球的皮层分离，并转移至另一含有新鲜HBSS的60 mm培养皿中。每次独立的神经元球培养至少使用3–5个胚胎。
5. 在超净台内的细胞培养罩中，用显微解剖弹簧剪将皮层组织剪成小块。
6. 将剪碎的皮层组织转移至15 mL离心管中，在37 °C水浴中用4 mL含0.125%胰蛋白酶的HBSS消化4.5分钟。
   注意：此胰蛋白酶消化时间对高效神经元培养至关重要，时间延长（> 4.5分钟）会导致大量神经元死亡。
7. 用无菌移液管将细胞团转移至另一含有10 mL HBSS的15 mL离心管中，于37 °C孵育5分钟。重复此步骤一次。
8. 将细胞团转移至另一含有2 mL含GlutaMax、B27添加剂的Neurobasal培养基（NGB培养基）、0.01% DNase I和10%马血清的15 mL离心管中。
9. 使用火焰抛光的精细玻璃巴斯德移液管反复吹打胰酶消化后的皮层组织（上下吹打3–5次）。
   注意：火焰抛光精细玻璃巴斯德移液管的直径非常关键，具体要求见Banker方法论文。若移液管过细导致组织无法通过，请准备2–3种不同口径的移液管，并从口径较大的开始尝试。
10. 为制备神经元球，取上述细胞悬液，用NGB培养基调整细胞密度至1 × 10⁶ 个细胞/mL。
11. 将皮层神经元以悬滴方式培养，每滴含10,000个细胞（每滴体积为10 µL），置于10 cm培养皿上盖内侧。
12. 在培养皿底部加入7 mL磷酸盐缓冲液（PBS），然后置于37 °C、5% CO₂ 、湿度充足的培养箱中培养3天，以促进神经元球的形成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27 增补剂（50倍浓度），无血清	Thermo Fisher Scientific	17504044
脱氧核糖核酸酶 1（DNase I）	Wako 纯化学品	047-26771
马血清	Sigma-Aldrich	H1270
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	#21103-049
胰蛋白酶	Nacalai Tesque	18172-94