使用悬滴培养技术开发神经元球

Abstract

来源:Parvin， S. et al.， 突触前形成测定使用突触前组织珠和"神经元球"培养。J. Vis. Exp. （2019 年）

该视频演示了使用悬滴培养技术生成神经元球的过程。在悬垂的液滴中，细胞向底部移动，自组装成三维结构，形成神经元球，可用于神经生物学研究。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 制备神经元球作为悬滴培养物（体外天数 （DIV） 0-3）

注意:此处描述的神经元球培养制备程序基于 Sasaki 小组之前报道的方法，并进行了一些修改。我们还采用了 Banker 方法中的几个程序来处理解离培养。

1. 在开始解剖之前确认以下内容
   1. 准备所有需要的溶液，并提前通过高压灭菌器/过滤对其进行消毒。
   2. 准备好这种皮层神经元培养的每个步骤中使用的所有仪器和材料。
   3. 用 70% 乙醇喷涂并擦拭层流柜、解剖台、立体显微镜载物台板、剪刀和镊子。
2. 在应用 CO₂ 时对小鼠实施安乐死，并解剖腹部以获得 E16 胚胎。
3. 在镊子的细尖的帮助下小心地从胚胎中取出大脑，并将它们转移到含有 4 mL 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸、HEPES 缓冲盐溶液 （HBSS） 的 60 mm 细胞培养皿中。
   注意:解剖培养基 HBSS 含有 10 mM HEPES （pH 7.4）、140 mM 氯化钠 （NaCl）、5.4 mM 氯化钾 （KCl）、1.09 mM 磷酸氢二钠 （Na₂HPO₄）、1.1 mM 磷酸二氢钾 （KH₂PO₄）、5.6 mM D-葡萄糖和 5.64 μM 酚红。
4. 去除头皮，切开嗅球，在立体显微镜下用镊子的细尖从每个大脑半球分离皮质，然后转移到另一个含有新鲜 HBSS 的 60 毫米培养皿中。每个单独的神经元球培养至少使用 3-5 个胚胎。
5. 在层流细胞培养罩中用显微解剖弹簧剪刀将皮质切成小块。
6. 将切碎的皮质转移到 15 mL 试管中，并在 37 °C 的水浴中将切碎的皮质在 4 mL 的 0.125% 胰蛋白酶和 HBSS 中胰蛋白酶消化 4.5 分钟><。 注意:这个胰蛋白酶消化时间对于有效的神经元培养至关重要，因为增加的时间（> 4.5 分钟）会导致更多的神经元死亡。
7. 通过无菌移液管将细胞聚集体转移到含有 10 mL HBSS 的新 15 mL 试管中，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。再重复此步骤一次。
8. 将细胞聚集体转移到含有 2 mL Neurobasal 培养基的新 15 mL 试管中，该试管含有 GlutaMax、B27 补充剂（NGB 培养基）、0.01% DNase I 和 10% 马血清。
9. 通过使用火焰抛光的精细玻璃巴斯德移液管反复上下移液（3-5 次）来研磨胰蛋白酶化的皮质。
   注意:正如 Banker 方法论文中所述，火焰抛光的精细玻璃巴斯德移液器的直径非常重要。如果移液管太窄而无法通过皮质，请准备具有 2-3 种不同尺寸的移液器，然后尝试使用较大的移液器。
10. 为了制备神经元球，取上述细胞悬液，并使用 NGB 培养基将细胞密度调节至 1 x 10⁶ 个细胞/mL。
在
11. 10 cm 培养皿的上盖内，将皮质神经元培养为含有 10,000 个细胞/滴（1 滴为 10 μL）的悬挂滴剂。
12. 在培养皿的底部加入 7 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），然后在加湿条件下在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中放置 3 天，以允许神经元球形成。

Materials