体外神经元与巨噬细胞共培养体系的建立

摘要

来源：Yun, H. J., 等. 用于激活巨噬细胞分泌具有神经突生长活性分子因子的神经元-巨噬细胞共培养体系。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了小鼠背根神经节神经元与巨噬细胞的共培养过程。神经元被接种于包被的培养板上，而巨噬细胞则从小鼠安乐死后获取，经处理后加入培养插件中。使用db-cAMP处理可激活神经元，并促使巨噬细胞转变为促再生表型，从而支持神经元轴突生长。

方案

1. 分离的成年背根神经节神经元或DRG神经元的培养准备

1. 在准备培养前，用多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白预包被一个6孔板。将6孔板与0.01%多聚-D-赖氨酸在37°C孵育2小时，或在4°C过夜。然后用蒸馏水洗涤平板两次。
2. 将平板与浓度为3 µg/mL的层粘连蛋白溶液在室温下孵育2小时，然后用蒸馏水洗涤平板两次。在室温下干燥平板至少1小时。
3. 将一只小鼠置于连接压缩CO₂气瓶的透明CO₂安乐死舱内。使用手术刀切开覆盖脊柱的皮肤，并双侧解剖椎旁肌以暴露椎骨。使用尖端较窄的手术咬骨钳仔细去除椎骨，直至背根神经节（DRGs）完全暴露。
   注意：成年DRG神经元来源于8至12周龄的成年C57BL6雄性小鼠。
4. 在解剖显微镜下，使用虹膜剪和精细镊子从S1水平至C1水平双侧取出DRGs。尽量将神经根完全从DRGs上剪除，以最大限度减少施万细胞或成纤维细胞的污染。
5. 将解剖得到的DRGs置于含有5 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的60 mm培养皿中，冰上保存，直至完成所有DRGs的收集。即使仍有未收集的DRGs，也应立即进入下一步操作。
   注意：必须尽快完成DRGs的解剖。从一只小鼠收集全部DRGs的时间不应超过30分钟。安乐死后30分钟，应停止收集DRGs并转入下一步。使用剪去末端的蓝色移液器吸头（1000 µL）将DRGs转移至1.5 mL离心管中。使用小型离心机短暂离心数秒后去除DMEM。加入1 mL含有125 U/mL XI型胶原酶的DMEM，并将离心管置于37°C培养箱中，在摇床上以35–40 rpm轻柔旋转孵育90分钟。使用胶带将离心管固定在摇床底部。
6. 弃去含胶原酶的DMEM，加入1 mL新鲜DMEM。等待漂浮的DRGs完全沉降至管底后，去除含有组织碎片的DMEM。重复此洗涤步骤至少六次。
   注意：不要试图完全弃去上清液。操作时需小心，避免将DRGs随上清DMEM一同移除。
7. 使用剪去末端的蓝色移液器吸头（1000 µL）将DRGs转移至15 mL锥形管中。然后使用蓝色吸头（1000 µL）轻柔吹打至少15次，以形成均一的细胞悬液。避免产生气泡，并尽量不要让移液器吸头接触锥形管底部。
8. 以239 × g离心3分钟，小心弃去含有漂浮碎片的上清液。加入1 mL添加B27（2.0% v/v）的Neurobasal培养基，通过轻柔吹打5至10次重悬细胞沉淀。
9. 将细胞悬液通过覆盖在50 mL锥形管上的70 µm细胞筛网过滤。等待2分钟后，使用移液器控制器将Neurobasal/B-27培养基加至筛网上方。
10. 将所有收集的DRG神经元（约来自一只小鼠的2 × 10⁶个DRG神经元）接种至6孔板的两个孔中。一只成年小鼠的DRG神经元可覆盖6孔板中的两个孔。随后将培养板置于37°C的CO₂培养箱中，直至进行巨噬细胞共培养。

2. 在细胞培养小室中共同培养原代腹腔巨噬细胞

注意：在解离的背根神经节神经元初次接种后 4 小时建立共培养体系

1. 从8至12周龄的成年C57BL6雄性小鼠中分离原代腹腔巨噬细胞。将动物置于CO2麻醉箱中实施安乐死。小心切开腹部皮肤，暴露腹膜，避免划破腹膜以防止灌洗液泄漏。
2. 使用带有22G针头的注射器穿刺腹膜，向腹腔内注入10 mL冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。轻轻按摩腹膜1–2分钟。然后拔出针头，通过穿刺部位将PBS挤出，并用50 mL锥形管收集灌洗液。
   注意：使用前将注射器置于冰上，以维持PBS的低温状态。
3. 将收集的灌洗液在4 °C条件下以239 × g离心10分钟，沉淀细胞成分。用3 mL红细胞裂解缓冲液（RBC lysis buffer）重悬沉淀，在室温下孵育3分钟。随后再次在4 °C条件下以239 × g离心10分钟。用3 mL PBS重悬细胞沉淀，并再次离心以彻底去除残留的红细胞裂解缓冲液。
   注意：务必确保完全去除红细胞裂解缓冲液，否则残留的裂解液可能对培养的巨噬细胞产生毒性。
4. 将细胞沉淀重悬于1 mL Neurobasal/B-27培养基中。将所收集巨噬细胞的一半（总计3 × 106至6 × 106个细胞）接种至有效面积为4.2 cm²的细胞培养小室中，并将其置于已分离的背根神经节（DRG）培养孔上方进行共培养。
   注意：在共培养期间，巨噬细胞生长于Neurobasal/B-27神经元培养基中。已证实巨噬细胞在此条件下可良好存活。

3. 二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）处理  巨噬细胞条件培养基的收集

注意：在神经元-巨噬细胞共培养 4 小时后开始 db-cAMP 处理。

1. 向神经元-巨噬细胞共培养体系中加入 2 µL 的 100 µM db-cAMP 溶液。对照实验中加入相同体积的 PBS。
2. 24 小时后，在同一 6 孔板中将一个空孔加入 1 mL 巨噬细胞培养基。将神经元-巨噬细胞共培养体系中的细胞培养小室转移至含有巨噬细胞培养基的空孔中。保持相同培养条件，72 小时内不更换培养基。
   注意：我们在收集条件培养基（CM）时仅加入 1 mL 巨噬细胞培养基，以获得浓缩的 CM。在收集 CM 过程中，如有需要，可额外添加培养基以完全覆盖插入小室中的巨噬细胞。
3. 72 小时后，将巨噬细胞条件培养基在 239 × g 下离心 5 分钟，以去除细胞成分。将上清液通过 0.2 µm 滤膜过滤，以去除残留的细胞碎片。将收集的条件培养基储存于 -70 °C，待后续使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养插件，透明PET膜，0.4μm孔径	Corning,Falcon	353090	适用于6孔板的透明PET膜，孔径0.4μm
70-μm尼龙细胞滤筛	Corning, Falcon	352350
红细胞裂解缓冲液	Qiagen	158904
Neurobasal培养基	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	含1% GlutaMAX和1%青霉素-链霉素
Poly-D-lysine氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin Thermo Fisher Scientific,	Invitrogen	23017-015
腺苷3',5'-环单磷酸N6,O2'-二丁酰钠盐	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
细胞培养CO2  培养箱	Panasonic	N/A