使用巨噬细胞条件培养基促进神经元突起生长

摘要

来源：Yun, H. J.，等。用于激活分泌具有促进神经突生长活性分子因子的巨噬细胞的神经元-巨噬细胞共培养体系。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种利用巨噬细胞条件培养基促进神经元突起生长（即神经突生长）的实验方法。将神经元与巨噬细胞在含cAMP的条件下共培养，并收集巨噬细胞分泌的条件培养基。用该条件培养基培养神经元可促进神经突的生长。这些神经突通过荧光标记后，可在荧光显微镜下进行观察和成像。

方案

1. Db-cAMP 处理及巨噬细胞条件培养基的收集

注意：在神经元-巨噬细胞共培养 4 小时后开始 db-cAMP 处理。

1. 向神经元-巨噬细胞共培养体系中加入 2 µL 的 100 µM 二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）溶液。对照实验中加入相同体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 24 小时后，在同一 6 孔板中将一个空孔加入 1 mL 巨噬细胞培养基。将神经元-巨噬细胞共培养体系中的细胞培养小室转移至含有巨噬细胞培养基的空孔中。保持相同培养条件，72 小时内不更换培养基。
   注意：我们在收集条件培养基（CM）时仅加入 1 mL 巨噬细胞培养基，以获得浓缩的 CM。在收集 CM 过程中，如需要，可额外添加培养基以完全覆盖插入小室中的巨噬细胞。
3. 72 小时后，将巨噬细胞条件培养基在 239 × g 下离心 5 分钟，以去除细胞成分。将上清液通过 0.2 µm 滤膜过滤，以去除残留的细胞碎片。收集的 CM 储存于 -70 °C，直至使用。

2. 利用收集的条件培养基进行神经突生长实验

1. 在建立分离的成年大鼠背根神经节（DRG）神经元培养之前，先用多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白预包被8孔腔室载玻片。将6孔板在37°C下用0.01%多聚-D-赖氨酸孵育2小时，或在4°C下过夜。随后用蒸馏水洗涤2次。
2. 将该板与浓度为3 µg/mL的层粘连蛋白溶液在室温下孵育2小时，然后用蒸馏水洗涤2次。在室温下干燥至少1小时。
3. 在添加了B27的Neurobasal培养基中获取解离的成年DRG神经元。将每孔5 × 10⁴个细胞接种至预包被的8孔腔室载玻片中。
4. 将腔室载玻片置于37 °C培养箱中孵育2小时，使细胞贴附于底部。随后，将培养基更换为已在37 °C预热的条件培养基（CM）。
   注意：在移除培养基和加入收集的条件培养基时，注意不要触碰8孔腔室载玻片的底部。
5. 初次接种后15小时，移除培养基并用PBS洗涤细胞一次。然后向各孔中加入200 µL冰上预冷的4%多聚甲醛溶液，在4 °C下固定20分钟。
   注意：用于轴突生长检测的DRG神经元培养时间必须精确控制为15小时。在此条件下，神经突起生长不明显。
6. 用冰上预冷的PBS洗涤3次，随后用含0.1% Triton-X的10%正常山羊血清（NGS）封闭30分钟。将固定后的细胞与用10% NGS稀释的一抗（抗Tuj-1）溶液（浓度为1 µg/mL）在室温下孵育4小时，或在4 °C下过夜。
7. 用PBS洗涤3次，然后在室温下与二抗（山羊抗小鼠）溶液孵育2小时。再次用PBS洗涤2次，使用封片液将培养载玻片加盖盖玻片（24 × 50 mm）封片。
8. 使用荧光显微镜成像以观察神经突起的生长情况（图1）。

结果

图1：使用不同条件下获得的条件培养基进行神经突生长实验的代表性结果。 （A, B）成年背根神经节（DRG）神经元经急性分离后培养15小时。接种2小时后，培养基更换为来自经PBS（A）或二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）（B）处理的神经元-巨噬细胞共培养体系所获得的条件培养基（CM）。仅经db-cAMP处理的CM表现出显著的神经突生长活性。（C, D）由单独培养的巨噬细胞（C）或神经元（D）经db-cAMP处理后获得的CM均不能支持神经突生长。比例尺为200 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养小室，透明PET膜，0.4 μm孔径	康宁，Falcon	353090	透明PET膜，孔径0.4 μm，适用于6孔板
70-μm 尼龙细胞筛	康宁，费尔康	352350
8孔培养板	Biocoat	354632	使用聚-D-赖氨酸均匀涂布
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技，Gibco	21103-049	含1% GlutaMax和1%青霉素-链霉素
B-27添加剂，无血清	赛默飞世尔科技，Gibco	17504-044	细胞外液
Glutamax	赛默飞世尔科技，Gibco	35050-061
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技，Gibco	15140-122
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
层粘连蛋白	赛默飞世尔科技，英坦奇	23017-015
N6,O2'-二丁酰基-3',5'-环磷酸腺苷钠盐	默克密理博公司，Calbiochem	28745
10% 正常山羊血清	赛默飞世尔科技	16210072
Triton-X-100	大贞化学金属公司	8566-4405
抗 β III 微管蛋白（Tuj-1）	Promega Corporation	G7121	小鼠单克隆抗体
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗	赛默飞世尔科技，英坦奇	A11005
血细胞计数板	马里恩费尔德-高级	N/A
细胞培养用CO2培养箱	松下	N/A
台式离心机	Sorvall	N/A
共聚焦显微镜	Olympus America Inc	IX71
FBS（胎牛血清）	VWR 国际，Hyclone	SH30919.03