使用巨噬细胞条件培养基促进神经元延伸

摘要

来源:Yun， H. J. et al. 神经元-巨噬细胞共培养以激活具有神经突生长活性的巨噬细胞分泌分子因子。J. Vis. Exp. （2018）。

该视频演示了一种使用巨噬细胞条件培养基促进称为神经突生长的神经元投射生长的测定方法。用 cAMP 共培养神经元和巨噬细胞，并收获巨噬细胞衍生的条件培养基。用条件培养基培养神经元可促进神经突生长。这些生长物被荧光标记并使用荧光显微镜观察。

方案

1. Db-cAMP 的处理和巨噬细胞条件培养基的收集

>注意:神经元-巨噬细胞共培养后 4 小时开始 db-cAMP 处理。

1. 将 2 μL 100 μM 二丁酰环腺苷酸 （db-cAMP） 溶液添加到神经元-巨噬细胞共培养物中。添加相同体积的磷酸盐缓冲盐蛋白 （PBS） 进行对照实验。
2. 24 小时后，在同一个 6 孔板中用 1 mL 巨噬细胞培养基填充空孔。将神经元 - 巨噬细胞共培养物中的细胞培养插入物转移到含有巨噬细胞培养基的空孔中。将细胞在相同条件下保持 72 小时而不更换培养基。
   注意:在条件培养基 （CM） 收集过程中，我们只添加 1 mL 巨噬细胞培养基来制备浓缩的 CM。在 CM 收集过程中，如果需要，我们添加更多以完全覆盖插入片段内的巨噬细胞。
3. 72 小时后，将巨噬细胞 CM 以 239 x g 离心 5 分钟以去除细胞成分。将上清液通过 0.2 μm 过滤器以去除任何残留的细胞碎片。将收集的 CM 储存在 -70 °C 直至使用。

2. 收集的 CM 的神经突生长测定

1. 在设置单独的成人 DRG 神经元培养物之前，用多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白预涂 8 孔室载玻片。将 6 孔板与 0.01% 聚-D-赖氨酸在 37°C 下孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜。然后，用蒸馏水清洗板子两次。
2. 将板与浓度为 3 μg/mL 的层粘连蛋白溶液在室温下孵育 2 小时，然后用蒸馏水洗涤板两次。在室温下干燥板至少 1 小时。
3. 在补充有 B27 的 Neurobasal 培养基中获得解离的成年 DRG 神经元。将 5 x 10⁴ 个细胞/孔接种到预包被的 8 孔腔室载玻片上。
4. 将腔室载玻片置于 37 °C 培养箱中 2 小时，让细胞附着在底部。然后，用预热于 37 °C 的解冻 CM 替换培养基><。 注意:去除培养基并添加收集的 CM 时，小心不要触摸 8 孔室载玻片的底部。
5. 初次铺板后 15 小时，去除培养基并用 PBS 洗涤细胞一次。然后，向孔中加入 200 μL 冰冷的 4% 多聚甲醛溶液，并将细胞与多聚甲醛溶液在 4 °C
   下孵育 20 分钟 注意:用于神经突生长测定的 DRG 神经元培养物应精确限制在 15 小时。在这种情况下，没有明显的神经突生长。
6. 用冰冷的 PBS 洗涤 3 次，然后用 10% 正常山羊血清 （NGS） 和 0.1% Triton-X 封闭 30 分钟。将固定细胞与用 10% NGS（浓度为 1 μg/mL）稀释的一抗（抗 Tuj-1）溶液在室温下孵育 4 小时或在 4 °C 下过夜。
7. 用 PBS 洗涤 3 次，然后在室温下将细胞与二抗（山羊抗小鼠）溶液孵育 2 小时。然后，用 PBS 洗涤两次，并使用封固液用盖玻片 （24 × 50 mm） 封固培养玻片。
8. 使用荧光显微镜拍摄图像以观察神经突生长（图 1）。

结果

图 1:使用从各种条件下获得的条件培养基进行神经突生长测定的代表性结果。（一、二）成年 DRG 神经元急性解离并培养正好 15 小时。铺板后 2 小时，将培养基替换为从用 PBS （A） 或二丁酰基 cAMP （db-cAMP） 处理的神经元-巨噬细胞共培养物中获得的条件培养基 （CM） （B）。只有用 db-cAMP 处理的 CM 表现出强大的神经突生长活性。（C、D）从仅由巨噬细胞 （C） 或神经元 （D） 组成的培养物中获得的 CM 经过 db-cAMP 处理，不支持神经突生长。比例尺表示 200 μm。

材料