使用微流控装置追踪运动神经元中细胞器的轴突运输

摘要

来源：Altman, T.，等。利用微流控室系统研究运动神经元培养物中细胞器的轴突运输。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种利用微流控腔室系统追踪运动神经元轴突运输的方法。该方法包括将小鼠胚胎脊髓组织培养在聚合物包被的孔中，并加入营养培养基以诱导轴突生长。通过活体成像观察荧光染料标记的细胞器的运动，可证实轴突的双向运输。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 微流控腔室或MFC的制备

1. 在初级模具中浇铸 PDMS（图 1）
   1. 根据详细方案购买或制备初级模具（晶圆）。
   2. 在进行涂覆步骤前，使用加压空气清除晶圆平台上的任何类型污物。晶圆表面应显得光滑且洁净。
   3. 用一个容器装入 50 mL 液氮。准备一支 10 mL 注射器和 23 G 针头。
      注意：从本步骤起的所有操作必须在化学通风橱中进行。
   4. 在化学通风橱内，使用注射器和针头吸取 2 mL 液氮。尽管看起来像是吸入了空气，但注射器内实际充满的是氮气（图 1A）。将装有晶圆的培养皿放入可密封的容器中。
   5. 拧开氯三甲基硅烷瓶盖，用装有氮气的注射器刺穿橡胶塞，将注射器内全部内容物注入瓶中。不拔出针头，将瓶子倒置，回抽 2 mL 氯三甲基硅烷。
      注意：由于注射器内压力作用，少量氯三甲基硅烷会从针头喷出。为避免危险，请将针头朝向通风橱内壁（图 1B）。
   6. 将氯三甲基硅烷均匀地喷洒在容器（来自步骤 1.1.4）内部，但不要直接接触晶圆或装有晶圆的培养皿。关闭容器，每片晶圆孵育 5 分钟。
      注意：若为首次使用氯三甲基硅烷对晶圆进行涂覆，应每片晶圆孵育 1 小时。
   7. 30 分钟内不得将晶圆和容器移出化学通风橱。
      警告：氯三甲基硅烷具有高度挥发性。
   8. 称取 PDMS 基液（见材料表）至 50 mL 离心管中，并按 16:1 的比例加入 PDMS 固化剂（例如，47.05 g 基液和 2.95 g 固化剂）。使用低速旋转器混合 10 分钟。
   9. 将 PDMS 浇注至每片装有晶圆的培养皿中，达到所需高度（图 1C）。
      注意：使用较薄的微流控腔室（厚度不超过 3–4 mm）可增强其与培养皿的粘附性，并防止泄漏。
   10. 将所有培养皿一同放入真空干燥器中处理 2 小时（图 1E）。此过程可去除 PDMS 内部夹带的空气，从而消除气泡，形成透明均匀的模具。
   11. 将培养皿置于 70 °C 烤箱中 3 小时（或过夜）（图 1E）。
       注意：将培养皿放入烤箱时应保持水平。
2. 在环氧树脂模具中浇铸 PDMS
   注意：由于晶圆制备成本高、需要特殊设备，且可能损坏脆弱的晶圆，因此可制作晶圆的环氧树脂复制品。这些复制品成本更低、更耐用，可用于微流控腔室的大规模生产。
   1. 将 PDMS 浇注并固化（如步骤 1.1.8–1.1.11 所述）至原始晶圆中。
   2. 取出 PDMS 并切除多余部分，仅保留用于加工成微流控腔室所需的微流控结构和功能区域。
   3. 立即用厚而粘性的胶带包裹 PDMS，以防其积聚灰尘。
   4. 选择一个组织培养级塑料培养皿，使整个 PDMS 能放入其中，并在周围留有空间用于浇注环氧树脂。PDMS 与塑料培养皿之间的距离应小于 5 mm。
   5. 准备少量 PDMS，按 10:1（基液：固化剂）的比例混合。新鲜的液态 PDMS 将用于将固态 PDMS 粘接到塑料培养皿底部。
   6. 在塑料培养皿底部中央涂抹极少量液态 PDMS，然后撕去 PDMS 上的粘性胶带，将其粘接到塑料培养皿底部。确保微流控结构朝上。
   7. 将 PDMS 在 70 °C 烤箱中固化 30 分钟。
   8. 通过在试管中按 100:45 的比例混合环氧树脂基液和固化剂来配制环氧树脂。不同环氧树脂的混合比例可能不同。常规 100 mm 培养皿所需的体积约为 40 mL。
   9. 在旋转器上混合环氧树脂 10 分钟，直至混合物明显均匀（即液体中无可见的纤维状杂质）。
   10. 将环氧树脂混合物在 400 × g 下离心 5 分钟，以去除其中夹带的气泡。
   11. 离心过程中，在培养皿壁及所有其他暴露的塑料部分周围涂抹一层薄薄的硅脂。这可以防止环氧树脂与塑料培养皿发生聚合，便于在实验结束时轻松取出固化的环氧树脂。
   12. 缓慢将环氧树脂倒入培养皿中，直至完全覆盖 PDMS 并至少超出 5 mm。保持移液管与培养皿之间零距离，以防止环氧树脂内部产生气泡。将培养皿放置在安全位置，使其在接下来的 48 小时内不被移动。
   13. 48 小时后，环氧树脂应已完全固化。将培养皿放入预热至 80 °C 的烤箱中，再加热 3 小时以完成最终固化。
   14. 通过轻轻拉扯塑料培养皿的侧壁直至其破裂，从而将固化的环氧树脂与塑料培养皿及原始 PDMS 模具分离。随后环氧树脂应能轻松脱离并剥离。
   15. 取出后，擦去新环氧树脂复制品上残留的硅脂，并将其倒置（即复制的微流控结构朝上）嵌入新的培养皿中。该环氧树脂复制品现已可用于 PDMS 浇铸。
   16. 使用加压空气或氮气吹除环氧模具上残留的 PDMS 或污物，并用异丙醇冲洗 2 次。第三次加入异丙醇后，在摇床上孵育 10 分钟。再次用异丙醇冲洗 3 次，弃去剩余液体。用空气或氮气吹干，或置于 70 °C 烤箱中烘干。
       注意：操作和废弃异丙醇时应遵循安全规程。
   17. 在浇铸前保持模具培养皿封闭。按步骤 1.1.8–1.1.11 操作。
3. 将 PDMS 打孔并雕刻成微流控腔室（MFC）（图 2）
   1. 使用手术刀沿晶圆上的 (+) 标记切割并从培养皿中取出 PDMS 模具。不要用力过猛，因为模具较脆弱（图 2A）。
   2. 根据示意图中的说明，根据实验设置对腔室进行打孔和切割（图 2B–F）。
      1. 用于脊髓组织块培养（图 2C, E）：在大型 MFC 的远端侧打两个 7 mm 的孔。定位时使这些孔与通道边缘重叠。在近端侧，于通道中央打一个 7 mm 的孔，重叠部分尽量小，以便为组织块留出足够空间。在近端通道的两个边缘再打两个 1 mm 的小孔。将 MFC 翻转，使微流控结构朝上，使用 20 G 针头在已打的 7 mm 孔内雕刻三个小型组织块凹槽。
      2. 用于解离运动神经元培养（图 2D, F）：在小型 MFC 的两个通道边缘共打四个 6 mm 的孔。
4. 对 MFC 进行灭菌以用于组织培养
   1. 在实验台上铺设 50 cm 长的粘性胶带。按压并回拉腔室，使其上下表面均接触胶带，以去除粗大污物。将清洁后的腔室放入新的 15 cm 培养皿中。
      注意：当微流控结构朝上时，切勿直接按压其上。
   2. 将腔室置于分析纯级 70% 乙醇中，在摇床上孵育 10 分钟。
   3. 弃去乙醇，并在组织培养通风橱或 70 °C 烤箱中干燥腔室。
5. 将 MFC 放置在玻璃底培养皿上
   1. 将腔室置于组织培养级 35 mm/50 mm 玻璃底培养皿中央，并在边缘施加轻微压力，使 PDMS 与培养皿底部粘合。为避免压碎玻璃底，始终应在坚固表面上施加压力。
   2. 在 70 °C 下孵育 10 分钟。按压腔室以增强其与培养皿的粘附性。
   3. 在紫外线下孵育 10 分钟。
6. 包被与培养
   1. 向两个腔室中加入 1.5 ng/mL 多聚-L-鸟氨酸（PLO）。通过在通道入口处反复吹打包被液，确保 PLO 流经通道。
   2. 在 10× 放大倍数的光学显微镜下检查微流控腔室，查看是否存在气泡。若气泡阻塞了微通道，则将 MFC 放入真空干燥器中处理 2 分钟。随后通过吹打包被液去除通道中残留的空气。过夜孵育。
   3. 用层粘连蛋白（溶于双蒸水，浓度为 3 µg/mL）替换 PLO，同样方式过夜孵育。
   4. 接种前，用神经元培养基清洗层粘连蛋白。

2. 神经元培养接种

1. 脊髓外植体培养
   1. 使用直剪刀和精细镊子，从 E12.5 的 ICR-HB9:GFP 小鼠胚胎中解剖出脊髓。操作在含 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 1× HBSS 溶液中进行（图 3A-C）。
   2. 使用显微解剖剪去除脑膜和背角（图 3D）。
   3. 将脊髓切成 1 mm 厚的横截面（图 3E）。弃去微流控装置（MFC）近端室中的所有培养基。
   4. 用移液器吸取总量为 4 µL 的单个脊髓外植体，将其尽可能靠近腔体处注入，并通过侧向出口（1 mm 打孔）吸出多余的液体。外植体应被吸入近端通道内。
   5. 缓慢向近端孔中加入 150 µL 脊髓外植体培养基（SCEX，见 材料表 和 表 3）。
   6. 脊髓外植体培养的维持
      1. 在近端室中加入 SCEX 培养基，在远端室中加入富含神经营养因子的 SCEX 培养基（含 50 ng/mL BDNF 和 GDNF 的 SCEX）。在远端孔（较高体积）与近端孔之间维持至少 15 µL/孔的体积梯度。
      2. 每 2 天更换一次培养基。轴突可能需要 3–5 天才能向远端延伸穿过通道。

3. 轴突运输（图4A）

1. 线粒体和酸性区室的标记
   1. 配制新鲜的 SCEX 培养基（或用于分离运动神经元的 CNB 培养基），其中加入 100 nM Mitotracker Deep Red FM 和 100 nM LysoTracker Red。在 37 °C 下孵育 30–60 分钟。只要荧光染料的发射光谱不重叠，也可使用其他颜色的染料。
   2. 用预热的 CNB/SCEX 培养基洗涤 3 次。培养板即可用于成像。
2. 活细胞成像
   1. 以每 3 秒一帧的频率采集轴突运输的延时图像序列，共采集 100 帧，每段视频总时长为 5 分钟。
      注意：本研究使用的成像系统包括一台倒置显微镜，配备转盘共聚焦装置，通过专用的细胞成像软件控制，使用 60 倍油镜（NA = 1.4）和 EMCCD 相机。成像过程中维持环境温度为 37 °C，CO₂ 浓度为 5%。
      注意：可根据实验需求采集更长或更短时间的延时视频。如有需要，甚至可进行过夜成像。然而，在采集视频时，关键是要尽量缩短曝光时间、降低激光功率，并减少总图像数量，以减轻光毒性和荧光淬灭。

结果

图1：硅胶模具的制备。 示意性图示描述了三甲基氯硅烷晶片清洗的步骤。(A) 首先，将50 mL液氮加入适当容器中。在化学通风橱内，使用注射器和针头吸取8 mL液氮。将注射器中的全部内容物注入三甲基氯硅烷瓶中。将瓶口朝下旋转，回抽8 mL三甲基氯硅烷。(B) 将三甲基氯硅烷铺展于容器内（不直接接触晶片）。容器需密闭，每种模具孵育5分钟。(C) 将液态PDMS倒入各晶片中，至所需高度。(D) 所有样品板一同放入真空干燥器中处理2小时，随后在70 °C烘箱中静置固化3小时（过夜）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35mm Fluodish – 玻璃底培养皿	World Precision Instruments WPI	FD35-100
50mm Fluodish – 玻璃底培养皿	World Precision Instruments WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD 相机	Andor
ARA-C（胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷）	Sigma-Aldrich	C1768	用过滤的双蒸水配制成 2 mM 储存液
B-27 补充剂（50X）	Thermo Fisher	17504044
BDNF	Alomone Labs	B-250	用含 0.01% BSA 的过滤双蒸水稀释至 10 µg/mL
1.25mm 活检打孔器	World Precision Instruments WPI	504530	用于制备大型 MFC
6mm 活检打孔器	World Precision Instruments WPI	504533	用于制备小型 MFC
7mm 活检打孔器	World Precision Instruments WPI	504534	用于制备大型 MFC
Bitplane Imaris 软件 - 版本 8.4.1	Imaris
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	在双蒸水中配制成 5% w/v 溶液
氯三甲基硅烷	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
CNTF	Alomone Labs	C-240	用含 0.01% BSA 的过滤双蒸水稀释至 10 µg/mL
密度梯度介质 - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNAse）	Sigma-Aldrich	DN-25	在 Neurobasal 培养基中配制成 10 mg/mL 储存液
Dow Corning 高真空硅脂	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	用于环氧树脂模具制备
DPBS 10X	Thermo Fisher	#14200-067	用双蒸水稀释 1:10
Dumont 精细镊子 #55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
环氧固化剂	Trias Chem S.R.L	IPE 743	用于环氧树脂模具制备
环氧树脂	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	用于环氧树脂模具制备
FIJI 软件	ImageJ
GDNF	Alomone Labs	G-240	用含 0.01% BSA 的过滤双蒸水稀释至 10 µg/mL
Glutamax 100X	Thermo Fisher	#35050-038
HB9:GFP 小鼠品系	Jackson Laboratories	5029
HBSS 10X	Thermo Fisher	#14185-045	用双蒸水稀释 1:10，加入 1% P/S 并过滤
iQ 软件	Andor
虹膜剪刀，弯型，10 cm	AS Medizintechnik	11-441-10
虹膜剪刀，直型，9 cm	AS Medizintechnik	11-440-09
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	#L-2020
Leibovitz's L-15 培养基	Thermo Fisher	11415064
LysoTracker Red	Thermo Fisher	L7528
MitoTracker Deep-Red FM	Thermo Fisher	M22426
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	21103049
Nikon Eclipse Ti 显微镜	Nikon
青霉素-链霉素（P/S）溶液	Biological Industries	03-031-1
多聚-L-鸟氨酸（PLO）	Sigma-Aldrich	#P8638	用过滤的 1X PBS 稀释 1:1000
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	DOW Corning Corporation	#3097358-1004
Vannas 弹簧式显微解剖剪刀，3 mm 刀片	F.S.T	15000-00