使用微流控装置追踪运动神经元中细胞器的轴突运输

摘要

来源：Altman, T.，等。利用微流控室系统研究运动神经元培养物中细胞器的轴突运输。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种利用微流控腔室系统追踪运动神经元轴突运输的方法。该方法包括将小鼠胚胎脊髓组织培养在聚合物包被的孔中，并加入营养培养基以诱导轴突生长。通过活体成像观察荧光染料标记的细胞器的运动，可证实轴突的双向运输。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 微流控腔室或MFC的制备

1. 在初级模具中浇铸 PDMS（图 1）
   1. 根据详细方案购买或制备初级模具（晶圆）。
   2. 在进行涂覆步骤前，使用加压空气清除晶圆平台上的任何类型污物。晶圆表面应显得光滑且洁净。
   3. 用一个容器装入 50 mL 液氮。准备一支 10 mL 注射器和 23 G 针头。
      注意：从本步骤起的所有操作必须在化学通风橱中进行。
   4. 在化学通风橱内，使用注射器和针头吸取 2 mL 液氮。尽管看起来像是吸入了空气，但注射器内实际充满的是氮气（图 1A）。将装有晶圆的培养皿放入可密封的容器中。
   5. 拧开氯三甲基硅烷瓶盖，用装有氮气的注射器刺穿橡胶塞，将注射器内全部内容物注入瓶中。不拔出针头，将瓶子倒置，回抽 2 mL 氯三甲基硅烷。
      注意：由于注射器内压力作用，少量氯三甲基硅烷会从针头喷出。为避免危险，请将针头朝向通风橱内壁（图 1B）。
   6. 将氯三甲基硅烷均匀地喷洒在容器（来自步....

结果

图1：硅胶模具的制备。 示意性图示描述了三甲基氯硅烷晶片清洗的步骤。(A) 首先，将50 mL液氮加入适当容器中。在化学通风橱内，使用注射器和针头吸取8 mL液氮。将注射器中的全部内容物注入三甲基氯硅烷瓶中。将瓶口朝下旋转，回抽8 mL三甲基氯硅烷。(B) 将三甲基氯硅烷铺展于容器内（不直接接触晶片）。容器需密闭，每种模具孵育5分钟。(C) 将液态PDMS倒入各晶片中，至所需高度。(D) 所有样品板一同放入真空干燥器中处理2小时，随后在70 °C烘箱中静置固化3小时（过夜）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35mm Fluodish – 玻璃底培养皿	World Precision Instruments WPI	FD35-100
50mm Fluodish – 玻璃底培养皿	World Precision Instruments WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD 相机	Andor
ARA-C（胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷）	Sigma-Aldrich	C1768	用过滤的双蒸水配制成 2 mM 储存液
B-27 补充剂（50X）	Thermo Fisher	17504044
BDNF	Alomone Labs	B-250	用含 0.01% BSA 的过滤双蒸水稀释至 10 µg/mL
1.25mm 活检打孔器	World Precision Instruments WPI	504530	用于制备大型 MFC
6mm 活检打孔器	World Precision Instruments WPI	504533	用于制备小型 MFC
7mm 活检打孔器	World Precision Instruments WPI	504534	用于制备大型 MFC
Bitplane Imaris 软件 - 版本 8.4.1	Imaris
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	#A3311-100G	在双蒸水中配制成 5% w/v 溶液
氯三甲基硅烷	Sigma-Aldrich	#386529-100ML
CNTF	Alomone Labs	C-240	用含 0.01% BSA 的过滤双蒸水稀释至 10 µg/mL
密度梯度介质 - Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556
牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNAse）	Sigma-Aldrich	DN-25	在 Neurobasal 培养基中配制成 10 mg/mL 储存液
Dow Corning 高真空硅脂	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA	用于环氧树脂模具制备
DPBS 10X	Thermo Fisher	#14200-067	用双蒸水稀释 1:10
Dumont 精细镊子 #55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T	1125520
环氧固化剂	Trias Chem S.R.L	IPE 743	用于环氧树脂模具制备
环氧树脂	Trias Chem S.R.L	RP 026UV	用于环氧树脂模具制备
FIJI 软件	ImageJ
GDNF	Alomone Labs	G-240	用含 0.01% BSA 的过滤双蒸水稀释至 10 µg/mL
Glutamax 100X	Thermo Fisher	#35050-038
HB9:GFP 小鼠品系	Jackson Laboratories	5029
HBSS 10X	Thermo Fisher	#14185-045	用双蒸水稀释 1:10，加入 1% P/S 并过滤
iQ 软件	Andor
虹膜剪刀，弯型，10 cm	AS Medizintechnik	11-441-10
虹膜剪刀，直型，9 cm	AS Medizintechnik	11-440-09
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	#L-2020
Leibovitz's L-15 培养基	Thermo Fisher	11415064
LysoTracker Red	Thermo Fisher	L7528
MitoTracker Deep-Red FM	Thermo Fisher	M22426
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher	21103049
Nikon Eclipse Ti 显微镜	Nikon
青霉素-链霉素（P/S）溶液	Biological Industries	03-031-1
多聚-L-鸟氨酸（PLO）	Sigma-Aldrich	#P8638	用过滤的 1X PBS 稀释 1:1000
Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	DOW Corning Corporation	#3097358-1004
Vannas 弹簧式显微解剖剪刀，3 mm 刀片	F.S.T	15000-00