从大鼠膀胱中分离和培养原代神经元与胶质细胞

摘要

来源：Wang, R. 等，成年大鼠膀胱原代神经元和胶质细胞的分离与培养。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种从大鼠膀胱组织建立神经元和胶质细胞原代培养的方法。该方法概述了组织制备、酶消化以获得单细胞，以及在神经元特异性培养基中培养细胞以建立原代神经元和胶质细胞培养的各个步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 材料准备

实验前使用高压灭菌器对所有器械和ddH₂O进行灭菌。器械包括但不限于手术剪、眼科剪、镊子、核分离勺、玻璃培养皿（直径60–100 mm）和玻璃烧杯。
配制Krebs溶液（表1）：使用前用ddH₂O溶解所有化学试剂。将CaCI₂单独溶解，并在搅拌条件下缓慢加入混合溶液中，以避免产生沉淀。
配制清洗液，其成分为含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素/抗真菌剂（100倍浓缩液）的F12培养基。向44.5 mL F12培养基中加入5 mL FBS和0.5 mL抗生素/抗真菌剂。
配制神经元培养基A，其成分为含2% B-27、1% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%抗生素/抗真菌剂（100倍浓缩液）和0.1%胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的Neurobasal A培养基。向9.5 mL Neurobasal A培养基中加入200 μL B-27、100 μL FBS、100 μL L-谷氨酰胺、100 μL抗生素/抗真菌剂（100倍浓缩液）和10 μL GDNF（10 μg/mL）。
注意：为确保B-27、L-谷氨酰胺和GDNF的新鲜度，应在使用前一周内配制神经元培养基A。
按照配制神经元培养基A的相同方法配制神经元培养基B，但不添加FBS。
在10 mL氧稳定的Krebs溶液中溶解20 mg II型胶原酶、6 mg牛血清白蛋白和200 μL抗生素/抗真菌剂（100倍浓缩液），配制消化液1。
将1 mL 0.25%胰蛋白酶用4 mL Hank's平衡盐溶液稀释，配制消化液2。
准备带有包被盖玻片的培养板。
1. 在超净工作台中使用镊子将玻璃盖玻片放入48孔细胞培养板中。
2. 用ddH₂O将聚-D-赖氨酸稀释至0.1 mg/mL浓度，作为聚-D-赖氨酸储备液。将储备液储存于–20 °C，使用前解冻。
3. 在每张盖玻片上加入40 μL聚-D-赖氨酸储备液，在室温下孵育10分钟。
  注意：针对不同底面积的培养板，调整浓度至4 μg/cm²。例如，若24孔板中每个孔的底面积为2 cm²，则应在每个孔中加入80 μL聚-D-赖氨酸储备液，使每cm²含有4 μg聚-D-赖氨酸。
4. 移除48孔板中的聚-D-赖氨酸，并用ddH₂O冲洗盖玻片三次。
5. 将培养板置于超净工作台中干燥至少30分钟，确保培养板无水。
6. 在进行层粘连蛋白包被前，可将培养板在4 °C保存最多1天；长期保存建议在−20 °C储存。
7. 在4 °C条件下解冻层粘连蛋白。用ddH₂O将层粘连蛋白稀释至50 μg/mL浓度，作为层粘连蛋白储备液。将储备液储存于–20 °C，使用前在4 °C解冻。
8. 用移液器将100 μL稀释后的层粘连蛋白转移至每张盖玻片表面，在4 °C孵育1小时。
  注意：针对不同底面积的培养板，调整浓度至5 μg/cm²。例如，若24孔板中每个孔的底面积为2 cm²，则应向每个孔中加入200 μL稀释后的层粘连蛋白，使每cm²含有5 μg层粘连蛋白。
9. 移除层粘连蛋白溶液，并用ddH₂O冲洗盖玻片一次。操作时应沿盖玻片边缘进行，避免刮擦。
  注意：包被后的盖玻片可在4 °C最多保存2周。

2. 膀胱的采集

取五周龄的Sprague–Dawley大鼠。
将Krebs溶液置于冰浴中，通入碳酰气（95% 氧气，5% CO₂）至少30分钟，以达到稳定的氧合状态和pH值。
通过颈椎脱位处死大鼠后，将其浸入75%乙醇中消毒30秒。
将大鼠置于灭菌的手术巾上，暴露腹部，使用剪刀和镊子切开腹腔并暴露膀胱。
轻柔提起膀胱，用另一套剪刀和镊子从膀胱颈部将其剪下，以避免交叉污染。迅速将膀胱放入冰冷、含氧稳定的Krebs溶液中，以提高细胞存活率。
注意：一旦取出膀胱，应迅速进行以下操作，以提高神经元存活的可能性。
向三个玻璃培养皿和玻璃烧杯中加入Krebs溶液。
将盛有Krebs溶液的玻璃培养皿和烧杯置于冰浴中预冷。
相应地标记这些容器为1–3号，以防止混淆。
为每个玻璃培养皿配备相应的镊子和勺状核分离器。
在1号玻璃培养皿中，用眼科剪刀剪开膀胱，并用镊子和勺状核分离器将其展开。
在1号玻璃烧杯中冲洗膀胱，然后将其转移至2号玻璃培养皿中。
在2号玻璃培养皿中，使用镊子和眼科剪刀去除组织表面附着的脂肪。
在2号玻璃烧杯中再次冲洗膀胱，然后将其转移至3号玻璃培养皿中。
在3号玻璃培养皿中，使用镊子和勺状核分离器轻轻刮擦膀胱，以去除外源性附着物。
在3号玻璃烧杯中冲洗膀胱，然后将其转移至含有14 mL冰冷Krebs溶液的15 mL离心管中，在4 °C条件下以356 × g 离心1分钟。
在另外两个装有Krebs溶液的离心管中重复上一步操作两次，以减少污染。

3. 两步膀胱消化法

将膀胱从离心管转移至含有1 mL消化液1的2 mL小瓶中。使用眼科剪在溶液中将膀胱剪成小块（小于1 mm）。
在无菌细胞培养皿（直径100 mm）中，将膀胱溶液与9 mL消化液1混合。在5% CO₂、37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中进行第1步消化，持续1小时。
第1步消化完成后，在4 °C条件下以356 x g 离心8分钟。
将消化液2置于37 °C水浴中预热。
离心后，弃去含有消化液1的上清液，收集细胞沉淀。允许残留少量液体，完全去除溶液可能导致细胞损失。
在15 mL离心管中，将细胞沉淀与预热的消化液2混合，并在37 °C水浴中边振荡边进行第2步消化，持续5分钟。第2步消化时间不得超过7分钟，否则神经元将死亡。
消化完成后，立即加入10 mL冷冲洗培养基以终止混合物中胰蛋白酶的活性。
注意：后续步骤应在0 °C–4 °C下进行，可使用冰浴提供该条件。
在4 °C条件下以356 x g 离心8分钟，收集细胞沉淀。尽可能彻底去除上清液，因为残留的胰蛋白酶会损害细胞生长。
用3 mL神经元培养基轻柔重悬细胞沉淀。操作时应避免在含细胞的溶液中产生气泡，以提高细胞存活率。
将混合液通过70 µm细胞滤筛过滤至50 mL离心管中。
将滤液置于冰浴中，以30 rpm振荡30分钟。此步骤非必需，但推荐执行。
在4 °C条件下以356 x g 离心8分钟收集细胞，并用1 mL神经元培养基A轻柔重悬细胞沉淀。
将500 µL细胞混合液加入已准备好的48孔板的每个孔中。
将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中进行培养。
1小时后更换为神经元培养基B，以提供无血清培养环境。
每3天更换一半的神经元培养基B。
注意：神经元培养5–7天后即可用于免疫细胞化学实验。

表1. 克雷布斯溶液成分

成分	摩尔浓度 (mM)
NaCI	120
KCI	5.9
NaHCO₃	25
Na₂HPO₄·12H₂O	1.2
MgCI₂·6H₂O	1.2
CaCI₂	2.5
葡萄糖	11.5

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Gibico	15050065	酶消化
48孔培养板	Corning	3548	包被培养皿
抗生素/抗真菌剂	Gibico	15240062	培养基/冲洗液
B-27	Gibico	17504044	培养基
BSA 第V组分	Gibico	332	酶消化
CO₂ 培养箱	Heraeus	B16UU	细胞培养
II型胶原酶	Sigma	2593923	酶消化
DMEM/F-12	Gibico	11330032	冲洗液
胎牛血清	Gibico	10100147	培养基/冲洗液
镊子	上海金钟医疗器械	1383	10 cm；无菌操作
玻璃烧杯	环球医疗器械	1101	50 ml；无菌操作
玻璃盖玻片	WHB Scientific	WHB-48-CS	包被培养皿
玻璃培养皿	环球医疗器械	1177	100 mm；无菌操作
超净工作台	苏洁医疗器械	CB 1400V	无菌操作
Murine GDNF	Peprotech	AF45044	培养基
Neurobasal-A 培养基	Gibico	10888022	培养基
眼科剪	上海金钟医疗器械	J21010	12.5 cm；无菌操作
移液器	Eppendorf	3120000240	100-1000 µl；试剂与样品移液
移液器	Eppendorf	3120000267	10-100 µl；试剂与样品移液
多聚赖氨酸（Poly-D-lysine）	Sigma	P7280	包被培养皿
冷冻离心机	平帆仪器	TGL-16A	酶消化
摇床培养箱	海门麒麟-贝尔实验室仪器	T8-1	酶消化
脑组织分隔勺	上海金钟医疗器械	YZR030	12 cm；无菌操作
手术剪	上海金钟医疗器械	J21130	16 cm；无菌操作
手术巾	福康医疗器械	5002	40 × 50 cm；无菌操作
层粘连蛋白（Laminin）	Sigma	L2020	包被培养皿
L-谷氨酰胺	Gibico	25030081	培养基

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