使用塑料微流控芯片的区室化原代小鼠神经元培养

摘要

来源：Nagendran, T.，等。使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了使用预组装的塑料微流控芯片对原代大鼠海马神经元进行区室化培养的方法。将神经元接种至微流控芯片的一个区室中，神经元在此附着并生长，并通过芯片中的微沟槽将其轴突延伸至相邻区室。由于微沟槽较窄，可阻止神经元胞体进入，从而实现胞体区室与轴突区室之间的物理分离。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 多室芯片的制备与包被

1. 在生物安全柜中，将芯片放入培养皿或其他合适的无菌容器中。
2. 向芯片的左上孔加入 100 µL 预包被液，使其流经主通道进入相邻的孔。
   注意：预包被液用于预先包被微流控通道，以避免芯片内形成气泡。
3. 向左下孔加入 100 µL 预包被液。等待 5 分钟，使溶液流过微沟槽。
4. 向芯片的右上孔加入 100 µL 预包被液，使其流经主通道进入相邻的孔。向右下孔加入 100 µL 预包被液。
5. 从各孔中吸除溶液。吸液时移液枪头应远离主通道，以避免吸走主通道中的液体 (图 1A)。立即向左上孔加入 150 µL 磷酸盐缓冲液 (PBS)。等待 1.5 分钟。
   注意：切勿将封闭的主通道中的液体全部吸除。
6. 向左下孔加入 150 µL PBS。等待 5 分钟，使液体流过微沟槽。向右上孔加入 150 µL PBS。向右下孔加入 150 µL PBS。等待 10 分钟。
7. 重复步骤 1.5–1.6，进行第二次 PBS 洗涤。
8. 在组织培养显微镜下检查芯片主通道中是否存在气泡。若存在气泡，则执行以下操作；若无气泡，则跳至步骤 1.9。
   1. 从各孔中吸除 PBS，移液枪头应倾斜远离通道开口 (图 1A)。
   2. 向上方孔中加入 100 µL 预包被液，移液枪头应靠近通道开口倾斜加入 (图 1B)。气泡应随液体移动至下方孔中。等待 1.5 分钟。
   3. 重复步骤 1.3–1.8。
9. 从各孔中吸除 PBS，移液枪头应倾斜远离通道开口 (图 1A)。
10. 向芯片左上孔加入 100 µL 浓度为 0.5 mg/mL 的多聚-L-赖氨酸 (PDL)。等待 1.5 分钟。向左下孔加入 100 µL PDL。
11. 向芯片右上孔加入 100 µL PDL。等待 1.5 分钟。向右下孔加入 100 µL PDL。
12. 盖上培养皿，将芯片置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
13. 重复 PBS 洗涤步骤 1.5–1.6 两次，以去除多余的 PDL。
14. 从装置中吸除 PBS。
15. 立即向芯片左上孔加入 100 µL 细胞培养基。等待 1.5 分钟。向左下孔加入培养基。向右上孔加入培养基。等待 1.5 分钟。向右下孔加入 100 µL 培养基。
16. 将芯片置于 37°C 培养箱中，直至准备接种细胞。

2. 将神经元接种至多区室芯片

1. 根据既定方案制备解离的大鼠海马神经元细胞悬液，使其密度约为 ~12 × 10⁶ 个细胞/mL。
   注意：可使用 3 至 12 × 10⁶ 个细胞/mL 范围内的细胞悬液密度。若使用较低密度，可增加加入芯片的细胞悬液体积。下述操作适用于小鼠解离的皮层或海马神经元。其他类型神经元的最佳细胞密度可能有所不同。
2. 吸除芯片各孔中的大部分培养基，每孔保留约 5 µL。吸液时应远离主通道，避免从主通道中移除液体 (图 1A)。
   注意：切勿从封闭的主通道中吸液。若从主通道中吸液，可能导致气泡滞留在芯片内。
3. 在右上孔中加入 5 µL 细胞悬液，同时在右下孔中加入另外 5 µL 细胞悬液（总计约 120,000 个细胞）。加样时应将细胞悬液靠近主通道处加入 (图 1B)。在显微镜下检查，确保神经元已进入主通道。静置 5 分钟，使细胞充分贴附。
   注意：神经元可加载至任一腔室。为便于说明，本文将右侧主通道定义为胞体腔室，但任一腔室均可作为胞体腔室使用。每芯片使用低至 60,000 个细胞的较低细胞密度亦可行。可结合细胞数量较少的细胞悬液，向胞体腔室的每个孔中最多加入 10 µL 细胞悬液。
4. 向右上和右下孔各加入约 150 µL 神经元培养基，随后向左上和左下孔各加入 150 µL 培养基。将芯片置于加湿托盘中，放入 5% CO₂、37 °C 培养箱中培养。
5. 24 小时后，通过从各孔中移除培养基进行换液。确保主通道始终保持充满状态。先向每个上孔加入 150 µL 培养基，再填充下孔。
6. 将芯片放回培养箱中继续培养所需天数。
   注意：每隔数天观察培养基颜色，确保其保持浅粉红色。若培养基呈黄色，应更换 50% 新鲜培养基。若液体量偏低，应确保足够的湿度，并对芯片采取适当的二次封闭措施以防止蒸发。通过使用二次封闭装置和/或用聚四氟乙烯（PTFE）-FEP 膜覆盖含芯片的培养皿，可减少或避免换液操作。

结果

图 1. 使用塑料多室芯片时需要掌握移液技术。 （A）在添加或吸出洗涤液时，移液器吸头应如图所示朝向主通道入口的反方向倾斜。（B）在接种神经元或进行轴突切断操作时，移液器吸头应朝向主通道入口的方向倾斜。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
XonaChip	Xona Microfluidics LLC	XC150	150 µm 长度的微沟槽屏障
	Xona Microfluidics LLC	XC450	450 µm 长度的微沟槽屏障
	Xona Microfluidics LLC	XC900	900 µm 长度的微沟槽屏障
XC pre-coat	Xona Microfluidics, LLC	XC Pre-Coat	随 XonaChips 提供
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
神经元培养基
Neurobassal 培养基	ThermoFisher Scientific	21103049
B-27 Plus 补充剂 (50x)	ThermoFisher Scientific	A3582801
GlutaMAX 补充剂	ThermoFisher Scientific	35050061
抗生素-抗真菌剂 (100x)	ThermoFisher Scientific	15240112
氟化乙烯丙烯薄膜	American Durafilm	50A	0.5 mil 厚度
玻璃巴斯德吸管	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA	5.75 英寸长度
PBS (10x)	ThermoFisher Scientific	QVC0508
培养箱，5% CO2，37 °C