在多电极阵列上培养小鼠螺旋神经节神经元外植体

摘要

来源：Hahnewald, S.，等 螺旋神经节神经元外植体培养及多电极阵列上的电生理记录。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了从内耳分离螺旋神经节组织块并将其与柯蒂氏器在多电极阵列上进行共培养的过程。螺旋神经节被小心地提取并切割成较小的组织片段或组织块。这些组织块被培养在多电极阵列的活性区域，以促进神经元突起的生长。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备实验用溶液

1. 制备细胞外基质（ECM）包被溶液（参见材料表）：将ECM混合物置于冰上解冻。用基础培养基（不含神经营养因子或胎牛血清（FBS））按1:10比例稀释ECM混合物，并保存在冰上。
2. 制备培养基（参见材料表）：配制不含FBS和脑源性神经营养因子（BDNF）的Neurobasal培养基储备液。在加入细胞培养物前，立即用新鲜FBS（10%）和BDNF（5 ng/ml）补充Neurobasal培养基。
3. 制备细胞外溶液（参见材料表）。

2. MEA 的清洗与灭菌

注意： 实验所用的多电极阵列（MEA）包含68个电极，呈矩形网格排列（图1E）。每个电极尺寸为40 × 40 µm²，电极中心间距为200 µm。电极材料为铂。电极通过由氧化铟锡构成的电路连接至相应的接触点，该电路由一层5 μm厚的SU-8材料绝缘。有关供应商的详细信息，请参见材料表。其他MEA布局也可能适用于本实验。

1. 对于新的微电极阵列（MEA）：将其浸入70%乙醇中30秒进行冲洗，再用蒸馏水洗涤30秒。操作需在超净工作台中进行。
2. 将MEA置于超净工作台中干燥30分钟。
3. 将每片MEA放入单独的无菌培养皿（35 mm × 10 mm）中，并用铝箔密封。MEA可在此条件下保存至使用。
4. 对于已使用的MEA：将MEA放入含有1 ml酶解溶液（见材料表）的培养皿（35 mm × 10 mm）中，在室温下置于摇床中过夜孵育，以去除生物材料。随后按步骤2.1继续操作。
   注意：使用橡胶包头镊子小心操作MEA。

3. 培养实验用多电极阵列的制备

1. 移除密封箔，将MEA保留在培养皿（35 mm × 10 mm）中，整个实验过程中均如此放置。
2. 使用步骤1.1中配制的溶液对MEA进行包被：用预先在-20 °C保存的冷200 µl移液枪头，向每个MEA加入50 µl包被溶液，确保完全覆盖电极区域。
3. 在室温下孵育30分钟至1小时，使MEA完成包被。
4. 用移液器吸除包被溶液。每孔加入100 µl含10% FBS和5 ng/ml BDNF的培养基，于室温下静置，直至进行组织接种。
5. 将两个含有已包被MEA的培养皿放入一个大培养皿（94 mm × 16 mm）中，并另加入一个小型培养皿，内含1.5 ml磷酸盐缓冲液（PBS），用于维持湿度。
   注意：添加含有PBS的小型培养皿（步骤3.5）对于显著减少培养基蒸发至关重要。

4. 螺旋神经节解剖

注意：粗略解剖可在超净工作台外进行（步骤 4.1 至 4.4）。精细解剖则必须在无菌条件下（超净工作台内）进行（从步骤 4.5 开始）。

1. 通过断头法处死动物（5至7日龄小鼠），无需预先麻醉。
2. 用70%乙醇喷洒头部进行消毒。
3. 握住头部，沿矢状线用锋利的剪刀切断皮肤与颅骨之间的连接。
4. 沿矢状面切开颅骨，并使用锋利/钝头剪刀取出脑组织。
5. 从颅骨上切下颞骨，并将其置于含有无菌冰冻Hanks平衡盐溶液（HBSS）的培养皿中。
6. 在解剖显微镜下，使用精细镊子分离鼓室泡，分离出内耳。
7. 使用精细镊子去除耳蜗的骨组织。
8. 用镊子夹住螺旋神经节（SG）基部和血管纹（SV），从基部向顶端缓慢旋转剥离，将螺旋韧带和血管纹（SV）一并去除。
9. 分离出柯蒂器官（OC）、螺旋神经节（SG）和蜗轴（图1A-C）。
10. 用镊子夹住螺旋神经节（SG）基部和柯蒂器官（OC），从基部向顶端缓慢旋转剥离，将柯蒂器官（OC）与螺旋神经节（SG）和蜗轴分开。
11. 使用镊子和显微手术刀，从仍附着于蜗轴的螺旋神经节上切取侧向外植体（直径200至500 µm）（图1D）。

5. 螺旋神经节外植体在微电极阵列上的培养

1. 将两个螺旋神经节外植体放置在预先加入 100 µl 培养基的多电极阵列（MEA）电极附近。
2. 将柯蒂氏器置于距离电极区域约 5 mm 的位置。
3. 使用镊子将外植体和柯蒂氏器固定在 MEA 上，注意避免损伤组织。
4. 小心将 MEA 放入培养箱中，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下进行培养。次日进行肉眼观察，确认外植体是否已贴附于 MEA。
   注意：若外植体过夜未贴附，则在接下来的几天内通常也不会贴附。柯蒂氏器被放置在培养物旁边以提供营养/神经营养支持。
5. 连续 5 天每天添加 100 µl 含 10% FBS 和 BDNF 的培养基。
6. 第 6 天，加入 2 ml 含 10% FBS 和 5 ng/ml BDNF 的培养基，并继续培养组织 13 天。

结果

图 1. 细胞培养制备。（A）新分离的小鼠内耳。白色虚线表示耳蜗的位置，黑色虚线表示前庭区域。（B）去除耳蜗骨壁后的小鼠内耳。耳蜗回旋由白色虚线标示。（C）解剖后显示的螺旋神经节（SG）和蜗轴、柯蒂器官（OC）、血管纹（SV）以及螺旋韧带。（D）螺旋神经节（SG）和柯蒂器官（OC）解剖及SG外植体制备示意图。（E）本研究中使用的多电极阵列示意图。记录电极呈矩形网格排列于中心区域，占据面积为2.2 mm²。图中还标示了4个接地电极和侧向接触电极。（F）培养方案示意图。记录在培养第18天进行。（G）在培养第1、6和18天于多电极阵列（MEA）上监测到的SG外植体的代表性图像（明场图像）及示意图。比例尺 = 400 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103-049	24 ml（配制 25 ml 用）
HEPES	Invitrogen	15630-080	250 μl（配制 25 ml 用）
Glutamax	Invitrogen	35050-061	250 μl（配制 25 ml 用）
B27	Invitrogen	17504-044	500 μl（配制 25 ml 用）
FBS	GIBCO	10099-141	10%（配制 25 ml 用）
BDNF	R&D Systems	248-BD-025/CF	终浓度 5 ng/ml（配制 25 ml 用）
NaCl			145 mM
KCl			4 mM
MgCl2			1 mM
CaCl2			2 mM
HEPES			5 mM
Na-丙酮酸盐			2 mM
葡萄糖			5 mM
PBS	Invitrogen	10010023
BSA	Sigma	A4503-50G	2%
Triton X-100	Sigma	X100	0.01%
35 mm 培养皿	Huberlab	7.627 102
94 mm 培养皿	Huberlab	7.633 180
Dumont #5 镊子	WPI	14098
Dumont #55 镊子	WPI	14099
酶解溶液：Terg-a-Zyme	Sigma	Z273287-11KG
细胞外基质（ECM）混合物：Matrigel TM	Corning	356230
MEA 电极	Qwane Biosciences		(瑞士洛桑)