小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元

摘要

来源：Hersbach, B. A. 等，小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了表达转化因子的星形胶质细胞直接重编程为神经元的过程。转化因子触发一系列分子事件，促进星形胶质细胞向神经元的转化。通过神经元分化培养基提供特定试剂和补充物，进一步支持该过程的进行。

方案

1. 星形胶质细胞接种用于重编程

注意：以下步骤必须在生物安全柜内且生物安全等级1（SL1）条件下进行。

1. 用与之前准备培养瓶相同的方法，准备含多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片的24孔板。为确定所需板数，需考虑星形胶质细胞的接种密度为5–5.5 × 10⁴ 每孔细胞数接种于24孔板中。通常，从出生后2天（P2）小鼠分离6个脊髓可获得约1 x 10⁶ 细胞
2. 吸弃含有培养星形胶质细胞的T25培养瓶中的培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C孵育5分钟，使星形胶质细胞从培养瓶壁上脱落。轻轻敲击培养瓶侧面，促使细胞脱离培养瓶表面，并在明场显微镜下使用10倍物镜观察细胞脱落情况。
3. 用2.5 mL星形胶质细胞培养基终止消化，将细胞悬液收集至15 mL离心管中。在300 × g下离心5分钟，吸除上清液，用1 mL星形胶质细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数系统计算细胞浓度。
4. 根据细胞数量，用新鲜星形胶质细胞培养基稀释细胞悬液，制备成浓度为1-1.1 × 10⁵ 个细胞/mL的细胞悬液。在培养基中添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），每种因子终浓度均为10 ng/mL。加入500 µL细胞悬液，相当于5-5.5 ×....

结果

图1：星形胶质细胞培养与重编程概述。（A）星形胶质细胞向神经元直接转化的时间线。每条黑线代表本方案中的一个重要步骤。（B）培养7天后来源于脊髓的星形胶质细胞的代表性明场图像。图像使用明场显微镜和10倍物镜拍摄。比例尺为100 µm。（C）以每孔5.5 × 10⁴个细胞的密度重新接种于24孔板中后1天的脊髓星形胶质细胞的代表性明场图像。图像使用明场显微镜和10倍物镜拍摄。比例尺为100 µm。（D）在接种后1天固定星形胶质细胞进行βIII-tub、Sox9、GFAP三重免疫荧光染色，以验证培养纯度。细胞用4%多聚甲醛固定10分钟，用1×PBS洗涤两次。使用含3% BSA和0.5% Triton-X 100的1×PBS溶液进行封闭。一抗用封闭液按适当浓度稀释（例如.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	25300054
B27 添加剂	Life Technologies	17504044
bFGF	Life Technologies	13256029
DMEM/F12	Life Technologies	21331020
Dorsomorphin	Sigma Aldrich	P5499
EGF	Life Technologies	PHG0311
胎牛血清	PAN Biotech	P30-3302
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886
Lipofectamine 2000（转染试剂）	Thermo Fisher	Cat# 11668019
OptiMEM – GlutaMAX（血清减少型培养基）	Thermo Fisher	Cat# 51985-026
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P1149