小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元

摘要

来源：Hersbach, B. A. 等，小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了表达转化因子的星形胶质细胞直接重编程为神经元的过程。转化因子触发一系列分子事件，促进星形胶质细胞向神经元的转化。通过神经元分化培养基提供特定试剂和补充物，进一步支持该过程的进行。

方案

1. 星形胶质细胞接种用于重编程

注意：以下步骤必须在生物安全柜内且生物安全等级1（SL1）条件下进行。

1. 用与之前准备培养瓶相同的方法，准备含多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片的24孔板。为确定所需板数，需考虑星形胶质细胞的接种密度为5–5.5 × 10⁴ 每孔细胞数接种于24孔板中。通常，从出生后2天（P2）小鼠分离6个脊髓可获得约1 x 10⁶ 细胞
2. 吸弃含有培养星形胶质细胞的T25培养瓶中的培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C孵育5分钟，使星形胶质细胞从培养瓶壁上脱落。轻轻敲击培养瓶侧面，促使细胞脱离培养瓶表面，并在明场显微镜下使用10倍物镜观察细胞脱落情况。
3. 用2.5 mL星形胶质细胞培养基终止消化，将细胞悬液收集至15 mL离心管中。在300 × g下离心5分钟，吸除上清液，用1 mL星形胶质细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数系统计算细胞浓度。
4. 根据细胞数量，用新鲜星形胶质细胞培养基稀释细胞悬液，制备成浓度为1-1.1 × 10⁵ 个细胞/mL的细胞悬液。在培养基中添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），每种因子终浓度均为10 ng/mL。加入500 µL细胞悬液，相当于5-5.5 × 10⁴ 个细胞⁴ 细胞，加入至先前制备的24孔板的每个孔中，并在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂.

2. 转录因子的强制表达

注意：在开始实验方案之前，必须合理设计实验。特别是，重编程实验必须包含阴性对照，即不表达任何重编程因子的条件。例如，当使用携带重编程因子cDNA和报告基因（如绿色荧光蛋白（GFP）、DsRed）的载体时，阴性对照应为仅携带报告基因的相同载体。当表达携带不同报告基因的多个因子时，阴性对照也应相应地进行调整。

1. 铺板后的第二天，检查24孔板，确保细胞已贴附在盖玻片上。
2. 根据实验目的和可用资源，可通过病毒转导（见步骤2.3）或DNA转染（见步骤2.4）实现重编程因子的强制表达。
   注意：使用逆转录病毒或慢病毒需要获得政府主管部门的批准，并且必须在生物安全等级2级（SL2）实验室的生物安全柜内进行操作。
3. 通过以下所述方法，使用携带目标重编程因子遗传信息的逆转录病毒或慢病毒感染细胞，从而对星形胶质细胞进行重编程。
   1. 将1 µL细胞悬液直接加入星形胶质细胞培养基中，使病毒滴度达到1 × 10¹⁰–1 × 10¹² 粒子/mL，以确保较高的感染率。将含有病毒颗粒的星形胶质细胞在37 °C下继续培养24–36小时，之后根据实验目的进入第3部分。
      注意：可使用不同的启动子驱动外源基因的表达（亦见代表性结果）。组成型启动子（如巨细胞病毒启动子（CMV）、鸡β-肌动蛋白启动子（CAG））比诱导型启动子更早启动外源基因的表达；然而，这两种类型的启动子均已成功用于将细胞重编程为神经元。
4. 也可通过以下所述的DNA转染方法将DNA质粒导入星形胶质细胞。
   注意：该操作可在符合SL1标准的生物安全柜内进行。
   1. 转染前，准备转染试剂、所需构建的质粒DNA、新鲜星形胶质细胞培养基以及低血清培养基（见材料表）。根据每孔24孔板需要300 µL低血清培养基计算所需体积。将相应体积的低血清培养基加入50 mL离心管中，并预热至37 °C。
   2. 当低血清培养基预热完成后，吸除各孔中的星形胶质细胞培养基并收集至50 mL离心管中。使用0.45 µm注射器滤器过滤收集的培养基，以去除脱落的细胞。
   3. 向滤过的培养基中加入等体积的新鲜星形胶质细胞培养基，配制成每孔可添加1 mL星形胶质细胞培养基的溶液。将星形胶质细胞条件培养基置于37 °C培养箱中保存，待用（见步骤2.4.9）。
      注意：培养基被重复使用，因其含有多种支持细胞存活的分泌因子。
   4. 向每孔加入300 µL预热的低血清培养基，并将24孔板放回培养箱中。
   5. 配制溶液A，包含DNA和低血清培养基。每孔使用总量为0.6 µg的DNA，溶于50 µL低血清培养基中。溶液A在室温下保存备用。
      注意：通常每个实验条件设置技术重复三孔。因此，建议配制足够3.5个反应使用的混合液（例如，将2.1 µg总DNA溶于175 µL低血清培养基），以确保有足够的溶液转染24孔板中的三个孔。
   6. 配制溶液B，包含转染试剂和低血清培养基。每孔加入0.75 µL转染试剂至50 µL低血清培养基中。由于该溶液适用于所有转染条件，建议批量配制以减少不同转染之间的差异。
   7. 将溶液B在室温下孵育5分钟。然后以1:1的比例逐滴将溶液B加入溶液A中，并轻轻混匀。禁止涡旋震荡。将混合后的溶液A+B在室温下于通风橱内孵育20–30分钟。
   8. 对所有转染条件重复步骤2.4.5–2.4.7。孵育20–30分钟后，将溶液A+B逐滴加入各孔，终体积为100 µL。轻轻摇动培养板，然后将细胞放回37 °C培养箱中继续培养4小时。
   9. 4小时后，移除转染培养基，并向每孔加入1 mL在步骤2.4.3中预先准备好的温热星形胶质细胞条件培养基。根据实验目的，在进入第3部分前继续培养细胞36–48小时。

3. 星形胶质细胞重编程（7天分析）

1. 通过将1 mL B27添加剂加入49 mL基础培养基中配制神经元分化培养基。根据细胞是否经过转导或转染（分别参见步骤2.3和2.4），在24–48小时后，将每孔中的星形胶质细胞培养基更换为1 mL神经元分化培养基，并在37 °C、9% CO₂条件下继续培养细胞₂.
   注意：细胞也可在5% CO₂条件下保存₂ 若无9% CO₂ 培养箱可用。然而，在这些条件下，神经元重编程的效率更高。
2. 可选：为提高重编程效率，在将星形胶质细胞培养基更换为神经元分化培养基时，补充Forskolin（终浓度30 µM）和Dorsomorphin（终浓度1 µM）。若选择使用Forskolin和Dorsomorphin处理细胞，则在首次处理后2天追加一次Dorsomorphin，直接加入培养基中。
3. 小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元细胞通常在换液后7天内发生（图1因此，在启动神经元重编程7天后，对细胞进行固定或收集，用于后续分析。

结果

图1：星形胶质细胞培养与重编程概述。（A）星形胶质细胞向神经元直接转化的时间线。每条黑线代表本方案中的一个重要步骤。（B）培养7天后来源于脊髓的星形胶质细胞的代表性明场图像。图像使用明场显微镜和10倍物镜拍摄。比例尺为100 µm。（C）以每孔5.5 × 10⁴个细胞的密度重新接种于24孔板中后1天的脊髓星形胶质细胞的代表性明场图像。图像使用明场显微镜和10倍物镜拍摄。比例尺为100 µm。（D）在接种后1天固定星形胶质细胞进行βIII-tub、Sox9、GFAP三重免疫荧光染色，以验证培养纯度。细胞用4%多聚甲醛固定10分钟，用1×PBS洗涤两次。使用含3% BSA和0.5% Triton-X 100的1×PBS溶液进行封闭。一抗用封闭液按适当浓度稀释（例如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	25300054
B27 添加剂	Life Technologies	17504044
bFGF	Life Technologies	13256029
DMEM/F12	Life Technologies	21331020
Dorsomorphin	Sigma Aldrich	P5499
EGF	Life Technologies	PHG0311
胎牛血清	PAN Biotech	P30-3302
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886
Lipofectamine 2000（转染试剂）	Thermo Fisher	Cat# 11668019
OptiMEM – GlutaMAX（血清减少型培养基）	Thermo Fisher	Cat# 51985-026
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P1149