制备用以观察听觉神经元的楔形脑切片

摘要

来源：Fischl, M. J. 等，体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在实验室环境中制备楔形脑片的过程。使用振动切片机，从小鼠脑组织中制备出不同厚度的楔形切片。该切片在一端较厚，包含听觉神经根，而与听觉相关的神经元则位于较薄的一端。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 保留听觉神经根以进行刺激的脑组织取出

注意： 本实验所用小鼠通过将背景为 C57BL/6J 的 ChAT-IRES-Cre 转基因小鼠与 tdTomato 报告基因小鼠（Ai14）杂交获得。用于组织学和电生理实验的小鼠为听力 onset 后（P14–P23）小鼠，相当于小鼠出生后约 P12 阶段。在腹侧梯形体核（VNTB）中表达 tdTomato 的神经元在此小鼠品系中已被先前研究鉴定为内侧耳蜗橄榄复合体（MOC）神经元。

1. 采用经批准的机构操作程序实施安乐死（例如，CO₂ 窒息法），然后将动物断头。
2. 使用剃刀刀片从鼻部至颈后沿颅骨中线切开皮肤，向后剥离皮肤以暴露颅骨。
3. 使用小型剪刀从颅骨基底部（靠近脊髓的尾端）沿中线向前至鼻部方向，在颅骨上做切口。
4. 在人字缝处，从颅骨中线向两侧耳部方向做横向切口。剥离颅骨以暴露脑组织。
5. 从脑的吻端开始，用小型实验铲或钝头镊子轻轻将脑组织从颅骨上抬起。切断视神经，并继续轻柔地向后分离脑组织，暴露脑干腹侧表面。
6. 用精细镊子在脑干腹侧表面附近夹断三叉神经。
   

结果

图1：楔形切片示意图及实例图像。（A）内侧橄榄耳蜗反馈回路示意图。蓝色箭头表示传入的上行通路至MOC神经元，黑色箭头表示从MOC神经元向下反馈至外毛细胞（OHC）基部的下行通路。（B）楔形切片的明场图像，厚侧标注了听觉神经根（ANR）和耳蜗核（虚线轮廓）。星号表示腹侧梯形体核（VNTB）的大致位置，该处MOC神经元位于楔形切片的薄侧，用于膜片钳记录。黑色虚线表示面神经，在切片的吻端表面两侧半球均可观察到。IHC—内毛细胞，GBC—球状树突细胞，SPN—上旁橄榄核，MNTB—内侧梯形体核，VNTB—腹侧梯形体核，LSO—外侧上橄榄核。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验准备
琼脂粉	Fisher Scientific	BP1423500	用于在振动切片过程中稳定脑组织的4%琼脂块
AlexaFluor Hydrazide 488	Invitrogen	A10436	用于细胞内溶液中的荧光染料，以确认MOC神经元膜片钳记录成功
分析天平	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	用于称量化学试剂
双刃剃须刀片	Ted Pella	121-6	振动切片机切割刀片
犬尿酸（5g）	Sigma Aldrich	K3375-5G	灌流ACSF添加剂，用于在解剖和切片过程中降低神经元活性，以改善组织健康状态，提高膜片钳实验成功率
pH计	Fisher Scientific (Intramalls)	13-620-451	溶液pH检测仪
塑料培养皿，直径100mm × 高20mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	用于制备4%琼脂
搅拌加热板	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	用于加热制备4%琼脂
解剖与切片
生物胞素（Biocytin）	Sigma Aldrich	B4261-250MG	用于轴突示踪的化学物质（与Streptavidin 488偶联）
解剖显微镜	Amscope	SM-1BN	用于脑组织取出过程中的精细解剖
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	精细解剖用镊子
经济型镊子 #3	WPI	501976	解剖用镊子
玻璃培养皿，直径150mm × 高15mm	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	解剖皿
界面滤膜（203 × 254 mm PCTE膜，孔径10 μm）	Thomas Scientific	1220823	用于脑片孵育及生物胞素处理
Leica VT1200S 振动切片机	Leica	1491200S001	用于楔形脑片切片的振动切片机
梅奥剪刀	Roboz	RS-6872	解剖工具
单刃碳素钢刀片	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	用于解剖的剃须刀片
定向标本盘	Leica	14048142068	专用于振动切片机的载物台，可实现可重复的倾斜角度
药匙	FisherSci	14-375-10	解剖工具
超级胶水	Newegg	15187	用于将组织粘附至振动切片机载物台
Vannas弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	解剖工具