制备用以观察听觉神经元的楔形脑切片

摘要

来源：Fischl, M. J. 等，体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了在实验室环境中制备楔形脑片的过程。使用振动切片机，从小鼠脑组织中制备出不同厚度的楔形切片。该切片在一端较厚，包含听觉神经根，而与听觉相关的神经元则位于较薄的一端。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 保留听觉神经根以进行刺激的脑组织取出

注意： 本实验所用小鼠通过将背景为 C57BL/6J 的 ChAT-IRES-Cre 转基因小鼠与 tdTomato 报告基因小鼠（Ai14）杂交获得。用于组织学和电生理实验的小鼠为听力 onset 后（P14–P23）小鼠，相当于小鼠出生后约 P12 阶段。在腹侧梯形体核（VNTB）中表达 tdTomato 的神经元在此小鼠品系中已被先前研究鉴定为内侧耳蜗橄榄复合体（MOC）神经元。

1. 采用经批准的机构操作程序实施安乐死（例如，CO₂ 窒息法），然后将动物断头。
2. 使用剃刀刀片从鼻部至颈后沿颅骨中线切开皮肤，向后剥离皮肤以暴露颅骨。
3. 使用小型剪刀从颅骨基底部（靠近脊髓的尾端）沿中线向前至鼻部方向，在颅骨上做切口。
4. 在人字缝处，从颅骨中线向两侧耳部方向做横向切口。剥离颅骨以暴露脑组织。
5. 从脑的吻端开始，用小型实验铲或钝头镊子轻轻将脑组织从颅骨上抬起。切断视神经，并继续轻柔地向后分离脑组织，暴露脑干腹侧表面。
6. 用精细镊子在脑干腹侧表面附近夹断三叉神经。
   注意：操作需格外小心，因为前庭蜗神经恰好位于其下方，需保持完整以备后续刺激使用。
7. 将制备好的脑组织置于盛有冷切片液的玻璃培养皿中，将培养皿放置于解剖显微镜下，并用碳氧混合气（carbogen）轻轻通气。
8. 在靠近脑干处修剪面神经，暴露前庭蜗神经。
9. 使用精细镊子将镊尖尽可能深入地插入前庭蜗神经穿出颅骨的孔道内，夹断神经，使神经根仍附着于脑干。在对侧重复此操作。
10. 待两侧神经根均游离后，清除脑桥三叉体附近脑干腹侧表面的脑膜和血管组织。
11. 通过夹断残留的脑神经和结缔组织，将脑组织完全从颅骨中分离，若可能，注意保留剩余的脊髓结构。

2. 将脑组织固定并安装到载物台（磁性圆盘）上

1. 通过在视交叉水平对脑组织进行修块，准备将其固定于切片台上。
   1. 将脑组织腹面朝上，使用钝头工具轻轻固定脊髓，以确保在后续步骤中脑组织不会倾斜。
   2. 在视交叉水平，使用张开的镊子插入脑组织直至培养皿底部，以创建修块平面。镊子插入角度约为垂直方向偏20˚，使镊尖从视交叉后方的脑背侧表面穿出。
   3. 沿镊子边缘用剃刀刀片进行切割。
2. 将脑组织粘附至切片台表面。
   1. 准备一小块（约1 cm³）4% 琼脂，用于支撑脑组织。
   2. 在切片台上滴加少量胶水，并将其涂抹成矩形区域，以便同时固定脑组织和琼脂块。
   3. 用镊子小心提起脑组织，用纸巾边缘轻轻吸去多余液体。将修块后的表面贴合至胶水上，切片时腹面将朝向刀片。
   4. 轻轻将琼脂块紧贴脑组织背侧表面，以在切片过程中提供支撑并确保脑组织位置正确（即角度合适）。

3. 切割脑组织以制备楔形切片

注意：使用振动切片机制备脑片，使耳蜗神经根位于较厚的一侧，而内侧橄榄耳蜗（MOC）神经元和斜方体主核（MNTB）位于较薄的一侧。

1. 将带有附着脑组织的磁盘放置于底座平台上，并将其放入切片室中，使脑的腹侧朝向刀片。
2. 向切片室中加入冰冷的切片液，并用碳合气（carbogen）持续通气。
3. 将刀片缓慢降至溶液中，从目标区域尾侧开始切片，以确保切片对称。若切片呈现不对称，可轻微倾斜平台以获得对称性。
   注意： 刀片切割速度在 0.05–0.10 mm/s 范围内可有效获得健康切片，具体速度可能因动物年龄和脑区不同而有所调整。
4. 当切片对称后，将平台向一侧偏转约 15˚（相当于平台底座上约 3 个同心环的距离）。
   注意： 偏转方向应远离需在切片中保留的听神经根。
5. 继续小心切片，直至一侧接近表面处可见听神经根，而对侧表面可见面神经。
6. 将平台回转 15˚ 至原始位置。
7. 将刀片移离组织，旋转平台底座 90°，使薄侧的外侧边缘正对刀片。将刀片下降数百微米，然后缓慢靠近组织边缘，重复此操作直至刀片接触外侧边缘。将刀片降至所需薄侧厚度，此处再额外下降 200 微米。
   注意： 最终切片在准备进行膜片钳记录的一侧，斜方体腹侧核（VNTB）水平的理想厚度约为 300 mm。
8. 将刀片移离组织，再将平台底座旋转回原位，使腹侧重新正对刀片。
9. 进行切割，以确定楔形切片的头端表面。将切片转移至一片界面滤纸（1 cm²）上，尾端面朝下。随后将切片转移至孵育室或其他合适的孵育装置中恢复 30 分钟（35 °C）。
   注意： 切片头端表面的两个半球均应可见面神经（见 图 1B）。

结果

图1：楔形切片示意图及实例图像。（A）内侧橄榄耳蜗反馈回路示意图。蓝色箭头表示传入的上行通路至MOC神经元，黑色箭头表示从MOC神经元向下反馈至外毛细胞（OHC）基部的下行通路。（B）楔形切片的明场图像，厚侧标注了听觉神经根（ANR）和耳蜗核（虚线轮廓）。星号表示腹侧梯形体核（VNTB）的大致位置，该处MOC神经元位于楔形切片的薄侧，用于膜片钳记录。黑色虚线表示面神经，在切片的吻端表面两侧半球均可观察到。IHC—内毛细胞，GBC—球状树突细胞，SPN—上旁橄榄核，MNTB—内侧梯形体核，VNTB—腹侧梯形体核，LSO—外侧上橄榄核。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验准备
琼脂粉	Fisher Scientific	BP1423500	用于在振动切片过程中稳定脑组织的4%琼脂块
AlexaFluor Hydrazide 488	Invitrogen	A10436	用于细胞内溶液中的荧光染料，以确认MOC神经元膜片钳记录成功
分析天平	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	用于称量化学试剂
双刃剃须刀片	Ted Pella	121-6	振动切片机切割刀片
犬尿酸（5g）	Sigma Aldrich	K3375-5G	灌流ACSF添加剂，用于在解剖和切片过程中降低神经元活性，以改善组织健康状态，提高膜片钳实验成功率
pH计	Fisher Scientific (Intramalls)	13-620-451	溶液pH检测仪
塑料培养皿，直径100mm × 高20mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	用于制备4%琼脂
搅拌加热板	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	用于加热制备4%琼脂
解剖与切片
生物胞素（Biocytin）	Sigma Aldrich	B4261-250MG	用于轴突示踪的化学物质（与Streptavidin 488偶联）
解剖显微镜	Amscope	SM-1BN	用于脑组织取出过程中的精细解剖
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	精细解剖用镊子
经济型镊子 #3	WPI	501976	解剖用镊子
玻璃培养皿，直径150mm × 高15mm	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	解剖皿
界面滤膜（203 × 254 mm PCTE膜，孔径10 μm）	Thomas Scientific	1220823	用于脑片孵育及生物胞素处理
Leica VT1200S 振动切片机	Leica	1491200S001	用于楔形脑片切片的振动切片机
梅奥剪刀	Roboz	RS-6872	解剖工具
单刃碳素钢刀片	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	用于解剖的剃须刀片
定向标本盘	Leica	14048142068	专用于振动切片机的载物台，可实现可重复的倾斜角度
药匙	FisherSci	14-375-10	解剖工具
超级胶水	Newegg	15187	用于将组织粘附至振动切片机载物台
Vannas弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	解剖工具