利用金纳米棒刺激神经元细胞分化

摘要

来源：Paviolo. 等，et al. 金纳米棒辅助的神经细胞光刺激。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种通过将神经细胞暴露于金纳米棒和激光光照射下以促进神经元分化的技术，该过程可形成由βIII-微管蛋白支撑的细胞突起。利用落射荧光显微镜对微管蛋白和细胞核进行染色与观察，可显示细胞的外向生长，表明金纳米棒在促进神经元分化方面的有效性。

方案

1. NG108-15 神经元细胞系培养和分化

1. 对于细胞培养基，制备 500 ml 无菌 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），其中含有 10% （w/v） 胎牛血清 （FCS）、1% （w/v） L-谷氨酰胺、1% （w/v） 青霉素/链霉素和 0.5% （w/v） 两性霉素 B.
   注意:补充剂可以等分，储存在 -20 °C，并在要求的日期添加到培养基中。细胞培养基可以在无菌条件下冷藏最长 1 个月。
2. 对于细胞分化培养基，制备 50 ml 无菌 DMEM，其中含有 1% （w/v） L-谷氨酰胺、1% （w/v） 青霉素/链霉素和 0.5% （w/v） 两性霉素 B。
3. 在加湿气氛（37°C时5%CO 2 ）的培养箱中，在由聚苯乙烯制成的T75烧瓶中的10ml细胞培养基中培养NG108-15神经元细胞。通常，在每个培养瓶中接种 1.5-2 × 10⁵ 个细胞，以便在 3-4 天内准备好。每两天更换一次细胞培养基。
   注意:为防止遗传漂变或变异，请勿使用早于第 21 代的细胞进行实验。
4. 当 70-80% 的培养物汇合时，用温暖的新鲜细胞培养基更换培养基。通过轻轻敲击汇合瓶的底部，机械地分离细胞。不要使用胰蛋白酶。
5. 将细胞悬液以 600 x g 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于 2 ml 温热的细胞分化培养基中。
6. 将 2 ×^{10 4} 个细胞/cm² 接种在含有 200 μl 细胞分化培养基的组织培养聚苯乙烯 96 孔板中。将实验在 5% CO2 / 37°C 下孵育 1 天。
7. 在第 2 天加入 3.2 × 10⁹ - 4.2 × 10¹⁰ 颗粒/ml 的纳米金棒 （Au NR） 溶液，再孵育 24 小时。不要添加用于对照实验的粒子。
   注意:作为替代对照，具有分化良好的峰值吸收波长的金纳米颗粒 （Au NPs） 可用于比较目的，为了获得更一致的细胞行为，请保持细胞密度恒定，并且在细胞接种前不要改变孔表面。

2. 神经突生长增强

1. 将激光器与单模光纤（数值孔径 = 0.13）耦合，并用光纤连接器端接（FC 连接器很方便且常用）。使用标准功率计测量输出激光功率。为了获得最有效的结果，请将激光的峰值波长与 NR 的等离子体共振峰相匹配。
2. 在 NR 孵育后的第 3 天，将 FC 连接器固定到孔上。在 RT 下以连续波照射样品和对照 1 分钟，以获得不同的激光功率。让培养物在 5% CO2 / 37 °C 下再进行 3 天。重复激光照射至少 3 次独立测量。
   注意:根据应用，可以选择不同的照射时间和脉冲频率。
3. 根据光束直径和激光辐照度 （W∙cm-2） 表征激光器。
   1. 对于标准单模光纤，使用 NA = n∙sinθ，其中 n 是所用介质的折射率，θ 是离开光纤的光锥的半角（参见图 1A）。根据三角学，r = tanθ∙d，其中 r 是光束半径，d 是纤维与样品之间的距离。FC 连接器与孔的直径相匹配，因此在距离 d = 2.70 ± 0.20 mm 处照射样品。光在水中从光纤中流出 （n = 1.33），得到 r = tan（sin-1（NA/n））∙d。
   2. 使用后一个方程，计算目标处的激光束半径、相应的光束面积和平均激光辐照度（激光功率除以光束面积）（参见图 1B 中的示例图）。这些值表示照明区域的平均辐照度。
   3. 使用误差传播的一般理论评估测量的误差。
      注意:FC 连接器和样品之间的距离可以通过使用适当软件（例如 ImageJ）对实验布置和图像后处理的照片来测量。
4. 第 5 天，从实验中取出细胞分化培养基，用 3.7% （v/v） 甲醛溶液固定样品 10 分钟，然后用 0.1% （v/v） Triton X-100 透化细胞 20 分钟。
5. 向样品中加入 3% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 60 分钟，以阻断未反应的蛋白质结合位点。在4°C下标记样品中的抗βIII-微管蛋白过夜（5μg/ ml在补充有1%BSA的PBS中）。
使用
6. 浓度为 0.4-2 μg/ml 的 1% BSA 中的 PBS 溶液，用适当的二抗（例如 TRITC（四甲基罗丹明）偶联的抗小鼠 IgG 抗体）在黑暗中孵育细胞 90 分钟。用 DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）（0.1 μg/ml 在去离子水中）标记细胞核 10 分钟
   注意:抗体偶联和浓度可能因公司方案而异。每个染色阶段后，用 PBS 洗涤样品两次，每次 5 分钟。
7. 使用至少 20 × 物镜通过落射荧光或共聚焦显微镜对样品进行成像。根据二抗选择显微镜滤光片。选择 DAPI 滤光片（λEX = 358 nm;λEM = 488 nm）以观察细胞核。
8. 通过评估来分析图片:i） 最大神经突长度（记录从神经突尖端到细胞体开始的长度），ii） 每个神经元细胞的神经突数量（总和每个细胞的所有神经突）和 iii） 具有神经突的细胞的百分比（将表达 βIII-微管蛋白的细胞总数除以具有阳性染色细胞核的细胞总数）

结果

图1. 光纤实验装置（A），以及激光束面积为0.4 mm²时，平均激光辐照度随激光功率的变化关系（B）。光束参数包括（A）：从光纤出射的最大光锥的半角（θ）、光束半径（r）以及光纤与样品之间的距离（d）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
FCS	Life Technologies	10100147
L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich	G7513
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122
两性霉素B	Life Technologies	15290018
甲醛	Sigma Aldrich	F8775
Triton X-100	BDH	T8532
BSA	Sigma Aldrich	A2058
抗βIII-微管蛋白抗体	Promega	G7121
TRITC标记的抗小鼠IgG抗体	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
紫外-可见分光光度计	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
小型离心机	Eppendorf	Mini Spin
超声波清洗仪	Unisonics Australia	FPX 10D
细胞培养箱	Kendro	Hera Cell 150
细胞培养离心机	Hettich	Rotofix 32A
激光二极管	Optotech	780 nm单模光纤耦合LD
光纤	Thorlabs	780 HP
功率计	Coherent	Laser Check
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
落射荧光显微镜	Axon Instruments	ImageX-press 5000A
PBS
聚苯乙烯96孔板
CO2
t75培养瓶