利用金纳米棒促进神经元细胞分化

摘要

来源：Paviolo. 等，et al. 金纳米棒辅助的神经细胞光刺激。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种通过将神经细胞暴露于金纳米棒和激光光照射下以促进神经元分化的技术，该过程可形成由βIII-微管蛋白支撑的细胞突起。利用落射荧光显微镜对微管蛋白和细胞核进行染色与观察，可显示细胞的外向生长结构，从而表明金纳米棒在促进神经元分化方面的有效性。

方案

1. NG108-15 神经细胞系的培养与分化

1. 为细胞培养基配制500 ml无菌的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），其中含10%（w/v）胎牛血清（FCS）、1%（w/v）L-谷氨酰胺、1%（w/v）青霉素/链霉素和0.5%（w/v）两性霉素B。
   注意：补充剂可分装后于 -20 ℃ 保存 °C，并在需要时加入培养基中。细胞培养基可在无菌条件下冷藏，最长保存1个月。
2. 对于细胞分化培养基，配制50 ml无菌DMEM，其中含1%（w/v）L-谷氨酰胺、1%（w/v）青霉素/链霉素和0.5%（w/v）两性霉素B。
3. 在聚苯乙烯材质的T75培养瓶中，加入10 ml细胞培养基，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养NG108-15神经元细胞 °C). 通常接种1.5-2 × 10⁵ 每瓶细胞将在3-4天内准备好。每两天更换一次细胞培养基。
   注意：为防止遗传漂变或变异，实验中请勿使用传代次数超过21代的细胞。
4. 当细胞培养至70-80%融合时，更换为预热的新鲜细胞培养基。通过轻轻敲击融合培养瓶的底部，机械性分离细胞。切勿使用胰蛋白酶。
5. 将细胞悬液在600 × g下离心5分钟，并将细胞沉淀重悬于2 ml预热的细胞分化培养基中。
6. 种子 2 × 10⁴ 细胞/厘米²² 在组织培养用聚苯乙烯96孔板中加入200 µ细胞分化培养基。在5% CO2、37℃条件下培养1天。 °C.
7. 添加 3.2 之间 × 10⁹ - 4.2 × 10¹⁰ 第2天加入每毫升含金纳米棒（Au NR）溶液的颗粒，继续培养24小时。对照实验不添加颗粒。
   注意：作为替代性对照，可使用具有明显不同峰值吸收波长的金纳米颗粒（Au NPs）进行比较。为获得更一致的细胞行为，应保持细胞密度恒定，并在接种细胞前不改变培养孔表面性质。

2. 神经突起生长增强

1. 将激光器与单模光纤（数值孔径 = 0.13）耦合，并使用光纤连接器（FC 连接器方便且常见）进行端接。使用标准功率计测量激光输出功率。为获得最佳效果，应使激光器的峰值波长与纳米棒（NRs）的表面等离子体共振峰相匹配。
2. 在NR孵育后的第3天，将FC连接器固定于孔板上。在室温下，以连续波模式用不同激光功率对样品和对照组照射1分钟。随后将细胞在5% CO2、37℃条件下继续培养3天。 °C. 对至少3次独立测量重复进行激光照射。
   注意：可根据具体应用选择不同的照射时间和脉冲频率。
3. 根据光束直径和激光辐照度（W）表征激光∙cm⁻²
   1. 对于标准单模光纤，使用 NA = n∙正弦θ，其中 n 为所用介质的折射率 θ 是光纤出射光锥的半角（参见 图1A）。根据三角学， r = tanθ∙d，其中 r 为光束半径，d 为光纤与样品之间的距离。FC 连接器与孔径直径相匹配，因此可在一定距离处对样品进行照明 d = 2.70 ± 0.20 mm。光在水中从光纤射出（n = 1.33），从而提供 r = tan(arcsin(NA/n))∙d.
   2. 利用后一个公式，计算靶点处的激光束半径、相应的光束面积以及平均激光辐照度（激光功率除以光束面积）（参见示例图表） 图1B）。这些数值代表了照射区域内平均辐照度。
   3. 利用误差传播的一般理论评估测量中的误差。
      注意：FC连接器与样品之间的距离可通过拍摄实验装置的照片，并使用适当的软件对图像进行后期处理来测量例如 ImageJ
4. 第5天，从实验中移除细胞分化培养基，用3.7%（v/v）甲醛溶液固定样本10分钟，随后用0.1%（v/v）Triton X-100对细胞进行20分钟的透化处理。
5. 加入3%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）溶液，室温孵育60分钟，以封闭未反应的蛋白结合位点。对样品进行标记以用于抗-βIII-微管蛋白过夜（5 µg/ml，溶于含1% BSA的PBS中）于4℃孵育 °C.
6. 在避光条件下，用适当的二抗孵育细胞 90 分钟（例如 TRITC（四甲基罗丹明）标记的抗小鼠 IgG 抗体，使用浓度为 0.4–2 µg/ml，溶于含1% BSA的PBS中。用DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）（0.1 µ在去离子水中稀释10分钟。
   注意：抗体偶联和浓度可能根据公司操作规程有所不同。每次染色步骤后，用 PBS 洗涤样本两次，每次 5 分钟。
7. 使用至少20倍的落射荧光或共聚焦显微镜获取图像样本× 目标。根据二抗选择显微镜滤光片。选择DAPI滤光片（λEX = 358 nm； λEM = 488 nm）以观察细胞核。
8. 通过以下指标分析图片：i) 最大神经突长度（记录从神经突末端至细胞体起始处的长度），ii) 每个神经元细胞的神经突数量（统计每个细胞的所有神经突总数），iii) 具有神经突的细胞百分比（用表达神经突的细胞总数除以 βIII-tubulin 阳性细胞数占细胞总数的比例（即具有阳性染色细胞核的细胞总数中 III-tubulin 阳性细胞所占比例）

结果

图1. 光纤实验装置（A），以及激光束截面积为0.4 mm²时，平均激光辐照度随激光功率的变化关系（B）。光束参数包括（A）：从光纤出射的最大光锥的半角（θ）、光束半径（r）以及光纤与样品之间的距离（d）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
FCS	Life Technologies	10100147
L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich	G7513
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122
两性霉素B	Life Technologies	15290018
甲醛	Sigma Aldrich	F8775
吐温X-100	BDH	T8532
BSA	Sigma Aldrich	A2058
抗βIII-微管蛋白抗体	Promega	G7121
TRITC标记的抗小鼠IgG抗体	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
紫外-可见分光光度计	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
小型离心机	Eppendorf	Mini Spin
超声波清洗仪	Unisonics Australia	FPX 10D
细胞培养孵箱	Kendro	Hera Cell 150
细胞培养离心机	Hettich	Rotofix 32A
激光二极管	Optotech	780 nm单模光纤耦合LD
光纤	Thorlabs	780 HP
功率计	Coherent	Laser Check
ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
落射荧光显微镜	Axon Instruments	ImageX-press 5000A
PBS
聚苯乙烯96孔板
CO2
t75培养瓶