从斑马鱼胚胎中建立原代视网膜神经节细胞培养

摘要

来源：Terzi, A.，等，神经元发育过程中的活性氧活细胞成像。J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了一种从斑马鱼胚胎中培养原代视网膜神经节细胞的方法。早期胚胎经过解剖以分离眼球，随后通过机械方法将眼球解离成视网膜神经节细胞悬液。该细胞悬液被接种于涂有黏附性蛋白的盖玻片上进行培养，以促进轴突的发育。

方案

1. 溶液的配制

1. E2 培养基（1x）
   1. 通过混合 表 1 中列出的所有组分，配制 100x E2A（500 mL）、500x E2B（100 mL）和 500x E2C（100 mL）溶液。对 E2A、E2B 和 E2C 溶液进行高压灭菌，4 °C 保存。
   2. 配制 1x E2 培养基：取 5 mL 100x E2A、1 mL 500x E2B 和 1 mL 500x E2C，用无菌水定容至 500 mL，调节 pH 至 7.0–7.5。
   3. 将 1x E2 培养基分装为 50 mL 份量，-20 °C 长期保存。但解冻时可能出现沉淀，使用前务必确保沉淀完全溶解。

表1：斑马鱼细胞培养用1x E2培养基的组分。

溶液	组分	用量	浓度
100X E2A (500 mL)
	NaCl	43.8 g	1500 mM
	KCl	1.88 g	50 mM
	MgSO4	6 g	100 mM
	KH2PO4	1.03 g	15 mM
	Na2HPO4	0.34 g	5 mM
500X E2B (100 mL)
	CaCl2	5.5 g	500 mM
500X E2C (100 mL)
	NaHCO3	3 g	350 mM
1X E2 (500 mL)
	100X E2A	5 mL	1X
	500X E2B	1 mL	1X
	500X E2C	1 mL	1X

2. E3 培养基（1x）
   1. 将组分溶解于 1 L 无菌水中，具体如表 2所示，配制成 100x 储存液。用无菌水稀释储存液，得到 1x E3 培养基。
   2. 加入 0.2% 亚甲蓝。对于 20 mL 的 1x E3 培养基，加入 40 µL 亚甲蓝。

表2：用于培养斑马鱼胚胎的100倍浓缩E3培养基的成分。

组分	质量 (g)	100X 储液中的浓度 (mM)
NaCl	29.22	500
KCl	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
MgSO4 7H2O	8.13	33

3. 80倍浓度盐溶液储备液
   1. 将 表3 中列出的所有组分混合，加水至总体积100 mL，搅拌至所有组分完全溶解。将溶液储存于4 °C。

表3：斑马鱼细胞培养基中80倍浓缩盐溶液的成分。

组分	质量 (g)	储存液浓度 (mM)
葡萄糖	1.44	80
丙酮酸钠	0.44	40
CaCl2 2H2O	0.148	10
HEPES	6.1	256

4. 斑马鱼细胞培养基（ZFCM+）
   1. 按表4所示成分配制250 mL培养基，调节pH至7.5。使用0.22 µm滤膜过滤培养基，并于4 °C保存。

表4：含血清和抗生素的斑马鱼细胞培养基成分。

组分	体积 (mL)	体积百分比
L-15 培养基（含酚红）	212.75	85.1
胎牛血清 (FBS)	5	2
青霉素/链霉素	1	0.4
80X 盐溶液	3.125	1.25
水	28.125	11.25

2. 源自斑马鱼胚胎的原代视网膜神经节细胞培养

注意：步骤 2.1 和 2.2 需在层流罩内进行。

1. 盖玻片的准备
   1. 每次实验准备4-6个培养板。使用经酸清洗并保存在100%乙醇中的盖玻片（22 × 22 mm 方形；厚度0.16–0.19 mm）。
   2. 用镊子从储存容器中取出一张盖玻片，并用火焰灼烧以去除残留的乙醇。
   3. 将盖玻片倾斜放置于35 mm培养皿内，使其在空气中完全干燥。
   4. 用无菌水将10x储存液（5 mg/mL）稀释，配制Poly-D-Lysine（PDL）工作液（1x）。
   5. 在每张盖玻片中央加入100 µL浓度为0.5 mg/mL的PDL溶液，避免溶液扩散至边缘。
   6. 在室温（RT）下孵育20–30分钟，确保PDL溶液不干燥。
   7. 用0.5 mL无菌水洗涤PDL三次。让培养板完全干燥。
   8. 用1x PBS将50x储存液（1 mg/mL）稀释，配制层粘连蛋白（laminin）工作液（1x）。
   9. 在每张盖玻片中央加入100 µL浓度为20 µg/mL的层粘连蛋白PBS溶液，避免溶液扩散至边缘。
   10. 将培养板置于37 °C湿化培养箱中孵育2–6小时。避免层粘连蛋白溶液干燥。
2. 胚胎解剖及视网膜神经节细胞（RGC）接种
   1. 在解剖当天，准备并标记四个35 mm组织培养皿，分别加入4 mL的以下溶液：70%乙醇、“E2培养基1”、“E2培养基2”、“E2培养基3”。解剖前将培养皿保存在冰箱中。
   2. 当斑马鱼胚胎发育至受精后34小时（hpf）时，从培养箱中取出已包被层粘连蛋白的培养皿，用0.5 mL 1x PBS洗涤盖玻片三次。
   3. 最后一次洗涤后，向每个培养皿中加入4 mL ZFCM(+)培养基，避免培养皿干燥。
   4. 取出步骤2.2.1中准备好的培养皿，使其平衡至室温（RT）。
   5. 向4–6个PCR管中各加入15 µL ZFCM(+)培养基。每张盖玻片接种所需的RGC需用4只眼睛制备，共需一个PCR管。
   6. 从培养箱中取出斑马鱼胚胎，将其浸入含有70%乙醇的35 mm组织培养皿中5–10秒以进行表面消毒。
   7. 使用移液器将胚胎转移至含有无菌E2培养基的E2培养基1皿中，以洗去多余的乙醇。
   8. 将胚胎转移至E2培养基2皿中，用尖头镊子去除胚胎的绒毛膜。
   9. 将胚胎转移至最终的E2培养基3皿中进行解剖操作。
   10. 使用一对精细镊子解剖出视网膜。
   11. 用一把镊子固定胚胎头部（位于卵黄前方），用另一把镊子剪除卵黄囊后方的尾部。
   12. 用镊子夹住颈部并取下头部，使脑组织和眼睛暴露于E2培养基中。注意避免刺破卵黄囊。
   13. 用精细镊子的尖端轻轻将眼睛从头部滚下，同时用第二把镊子固定颅部组织。保持眼睛与周围组织碎片分离。
   14. 将4只眼睛转移至先前准备好的一个含有ZFCM(+)的PCR管中。
   15. 用P20移液器和黄色吸头轻柔吹打约45次，使细胞充分解离。避免产生气泡。
   16. 将含有解离细胞的ZFCM(+)培养基滴加至盖玻片中央。对其他盖玻片重复步骤10–12。
   17. 将培养物置于22 °C的 benchtop 上，放置在聚苯乙烯泡沫支架上以吸收震动。
   18. 接种后6–24小时进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿	Sarstedt	83-3900
二水合氯化钙	Fisher Scientific	C79-500
盖玻片	Corning	2850-22
一次性培养皿（100 × 15 mm）	VWR	25384-094
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140087
葡萄糖	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
层粘连蛋白	ThermoFisher Scientific	23017-015
无酚红 Leibovitz L-15 培养基	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
青霉素/链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
多聚-D-赖氨酸（PDL）	Sigma Aldich	P7280
丙酮酸钠	Sigma Aldich	P5280
0.22 μm Steritop 滤器	Millipore	S2GPT05RE