由血液来源的多能干细胞生成神经元细胞

摘要

来源：Becker-Kojić, Z. A.，等。无转基因方法生成血液来源的神经元细胞。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种从血液来源的多能干细胞（BD-PSCs）诱导生成神经元细胞的技术。BD-PSCs 是通过采集血液样本后分离获得的 通过 重编程血液祖细胞。未分化的BD-PSCs在包被有细胞培养基质的盖玻片上培养，使用神经诱导培养基和神经分化培养基，诱导其分化为具有神经元表型的细胞。

方案

进行实验时已获得伦理批准。

1. 人外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离

1. 确保所有供血者在采血前均已签署知情同意书，并符合机构指南的要求。
2. 由经过培训的医务人员根据标准操作规程从健康供血者采集 30 mL 血液。
3. 使用密度梯度介质分离外周血单个核细胞（PBMNCs）。将 10 mL 介质与 25 mL 用磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:1 稀释的血液混合，于 300 x g 离心 30 分钟。
4. 用移液器吸取血浆层与密度梯度介质之间的中间层。用 5 mL 无菌 PBS 洗涤分离的细胞，并于 300 x g 离心 10 分钟，重复洗涤两次。
5. 使用计数板通过标准方法对细胞数量进行计数。

2. 通过抗体交联激活外周血单个核细胞表面的人源糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定糖蛋白

1. 将6 × 10⁶ 个单个核细胞（MNCs）置于15 mL离心管中，加入针对人GPI锚定膜蛋白的特异性抗体（30 µg/mL），在含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中于37 °C孵育30分钟，进行抗体交联。
2. 将孵育液更换为添加了1....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
白蛋白第五组分	Roth	T8444.4
AO/PI细胞活力检测试剂盒	Biozym	872045	Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。
抗坏血酸-2-磷酸镁盐	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27无血清培养基（50倍浓缩）	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
碱性成纤维细胞生长因子溶液	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	密度梯度介质
BSA第五组分 7.5%	Gibco	15260037
CD45微磁珠	Miltenyi	130-045-801	纳米级磁性微珠
Luna细胞计数板	Biozym	872010	Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。
D-MEM/F12培养基	Merck Millipore	FG4815-BC
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	已停产。可从TMS-013-B获取
人重组GDNF	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax（100倍浓缩）	Gibco	35050038	L-谷氨酰胺
肝素钠（细胞级）	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
人源BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove改良DMEM（IMDM）	Biochrom	FG0465
小鼠层粘连蛋白	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Luna FL全自动细胞计数仪	Biozym	872040	Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。
MACS缓冲液	Miltenyi	130-091-221
MEM非必需氨基酸（100倍浓缩）	Gibco	11140035
MiniMACS分离柱	Miltenyi	130-042-201
Nunclon四孔多孔板	Fisher Scientific	10507591
N2添加剂（100倍浓缩）	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal培养基	Gibco	10888022
无菌PBS	Roth	9143.2
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957-50ML