由血液来源的多能干细胞生成神经元细胞

摘要

来源：Becker-Kojić, Z. A.，等。无转基因方法生成血液来源的神经元细胞。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种从血液来源的多能干细胞（BD-PSCs）诱导生成神经元细胞的技术。BD-PSCs 是通过采集血液样本后分离获得的 通过 重编程血液祖细胞。未分化的BD-PSCs在包被有细胞培养基质的盖玻片上培养，使用神经诱导培养基和神经分化培养基，诱导其分化为具有神经元表型的细胞。

方案

进行实验时已获得伦理批准。

1. 人外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离

1. 确保所有供血者在采血前均已签署知情同意书，并符合机构指南的要求。
2. 由经过培训的医务人员根据标准操作规程从健康供血者采集 30 mL 血液。
3. 使用密度梯度介质分离外周血单个核细胞（PBMNCs）。将 10 mL 介质与 25 mL 用磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:1 稀释的血液混合，于 300 x g 离心 30 分钟。
4. 用移液器吸取血浆层与密度梯度介质之间的中间层。用 5 mL 无菌 PBS 洗涤分离的细胞，并于 300 x g 离心 10 分钟，重复洗涤两次。
5. 使用计数板通过标准方法对细胞数量进行计数。

2. 通过抗体交联激活外周血单个核细胞表面的人源糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定糖蛋白

1. 将6 × 10⁶ 个单个核细胞（MNCs）置于15 mL离心管中，加入针对人GPI锚定膜蛋白的特异性抗体（30 µg/mL），在含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中于37 °C孵育30分钟，进行抗体交联。
2. 将孵育液更换为添加了10%胎牛血清（FBS）的Iscove改良Dulbecco培养基。
3. 将细胞置于15 mL聚苯乙烯管中，在37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养8–10 天（无需摇动）。在第5天（D5）时，向每根15 mL管中额外添加1–2 mL含10% FBS的Iscove培养基。

3. 新生去分化细胞的分选

1. 使用自动细胞计数器（18 µL 细胞悬液 + 2 µL 荧光染料）或血细胞计数板对细胞进行计数。
2. 将培养的细胞悬液（5-7 × 10⁶）在 300 × g 条件下离心 10 分钟，并用无菌巴斯德吸管吸除上清液。
3. 用 90 µL 预冷的 PBS（pH 7.2），含 0.5% BSA 和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）重悬细胞沉淀。
4. 向细胞悬液中加入 CD45 阳性纳米级磁珠（80 µL），冰上孵育 15 分钟。
5. 加入 2 mL PBS 缓冲液洗涤细胞，在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
6. 将细胞重悬于 500 µL PBS 缓冲液中。
7. 用 500 µL 预冷的 PBS 缓冲液冲洗层析柱，并将其置于磁场中。
8. 将细胞悬液上样至层析柱，用 500 µL PBS 缓冲液洗涤两次，收集穿流液中的 CD45 阴性细胞，将其收集至添加 1% BSA 的 Iscove 培养基中。
9. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。

4. 准备细胞培养皿以进行新生成干细胞的神经元分化

1. 使用多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被培养器皿，用于培养神经元细胞。
2. 将玻璃盖玻片放入4孔板中，并加入1:5稀释的多聚-L-鸟氨酸（0.1 mg/mL，溶于重蒸水[ddH₂O]）包被，置于ddH₂O中。将盖玻片放入37 °C培养箱中孵育1小时，然后用ddH₂O洗涤。
3. 缓慢融化层粘连蛋白（0.5–2.0 mg/mL），并滴加至盖玻片表面。在37 °C下孵育2小时。
4. 配制含N2添加剂的神经诱导培养基N2：取49 mL的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（D-MEM/F12），加入500 µL N2添加剂、400 µL非必需氨基酸（NEAA）、终浓度为20 ng/mL的基础成纤维细胞生长因子（FGF）溶液（由100 µg/mL储备液稀释而成），以及终浓度为2 ng/mL的肝素。
5. 用移液器吸除多余的层粘连蛋白，向培养皿中加入含N2的神经元培养基。

5. 神经元去分化血细胞的培养

1. 将BD来源的CD45阴性细胞接种于铺有层粘连蛋白/鸟氨酸的玻璃盖玻片上，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2天₂ 在N2培养基中诱导新生成的BD细胞向神经元分化。
2. 在神经元分化培养基中继续培养细胞，该培养基由以下成分组成：48 mL Neurobasal 培养基、500 µL L-谷氨酰胺、1 mL B27 补充剂、500 µL NEAA、50 µL 溶于 PBS/0.1% BSA 的重组人胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，5 µg/250 µL）、50 µL 溶于 PBS/0.1% BSA 的重组人脑源性神经营养因子（BDNF，5 µg/200 µL）以及 50 µL 溶于 PBS 的抗坏血酸溶液（2.9 g/50 mL）。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。₂.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
白蛋白第五组分	Roth	T8444.4
AO/PI细胞活力检测试剂盒	Biozym	872045	Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。
抗坏血酸-2-磷酸镁盐	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27无血清培养基（50倍浓缩）	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
碱性成纤维细胞生长因子溶液	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	密度梯度介质
BSA第五组分 7.5%	Gibco	15260037
CD45微磁珠	Miltenyi	130-045-801	纳米级磁性微珠
Luna细胞计数板	Biozym	872010	Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。
D-MEM/F12培养基	Merck Millipore	FG4815-BC
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	已停产。可从TMS-013-B获取
人重组GDNF	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax（100倍浓缩）	Gibco	35050038	L-谷氨酰胺
肝素钠（细胞级）	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
人源BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove改良DMEM（IMDM）	Biochrom	FG0465
小鼠层粘连蛋白	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Luna FL全自动细胞计数仪	Biozym	872040	Biozym已停产。该产品由Logos Biosystems生产。
MACS缓冲液	Miltenyi	130-091-221
MEM非必需氨基酸（100倍浓缩）	Gibco	11140035
MiniMACS分离柱	Miltenyi	130-042-201
Nunclon四孔多孔板	Fisher Scientific	10507591
N2添加剂（100倍浓缩）	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal培养基	Gibco	10888022
无菌PBS	Roth	9143.2
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957-50ML