磁性纳米颗粒负载神经元在磁性平台上的生长与分化

摘要

来源：Indech, G.，等。用于互连神经元微尺度组装的磁性平台制备。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了神经元细胞通过内吞作用摄取荧光磁性纳米颗粒（MNPs）的过程。将负载MNPs的神经元培养在磁性图案化基底上，可实现细胞的附着。添加含有生长因子的培养基有助于神经元突起的生长，而基底的磁场则引导突起的取向。

方案

1. 细胞对磁性纳米颗粒（MNP）的摄取

1. 通过向 Roswell Park 医学研究所（RPMI）培养基中添加 10% 马血清（HS）、5% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素和 0.2% 两性霉素制备 PC12 细胞培养的基础生长培养基，并使用 0.22 µm 尼龙滤器过滤。
2. 向 RPMI 培养基中加入 1% 马血清（HS）、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素和 0.2% 两性霉素，制备 PC12 分化培养基，并使用 0.22 µm 尼龙滤器过滤。
3. 在未处理的培养瓶中加入 10 mL 基础生长培养基培养细胞；每 2–3 天向培养瓶中添加 10 mL 新鲜基础生长培养基，并在 8 天后进行传代培养。
4. 进行细胞摄取时，在离心管中将细胞悬液于室温下以 200 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
5. 用 3 mL 新鲜基础生长培养基重悬细胞。再次于室温下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，然后用 3 mL 新鲜分化培养基重悬细胞。
6. 使用注射器和针头反复吹打细胞 10 次以分散细胞团块。使用血细胞计数板计数细胞，并将 10⁶ 个细胞接种至普通的未包被 35 mm 培养皿中。
7. 向培养皿中加入计算好的磁性纳米颗粒（MNP）悬液体积和分化培养基体积，以达到所需的 MNP 浓度和总体积。混合细胞、MNPs 和分化培养基后，将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 24 小时。
8. 将细胞悬液于室温下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 1 mL 新鲜分化培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。

2. 磁性平台上的细胞分化与生长

1. 用70%（v/v）乙醇清洗图案化基底，并将基底放入生物安全柜中的35 mm培养皿内。在图案化基底下方放置一块强磁体（约1500奥斯特），作用1分钟，然后先将培养皿垂直向上移离磁体，再将磁体移出安全柜。打开紫外灯照射15分钟。
2. 用1:50比例将I型胶原（大鼠尾来源溶液）稀释于30%（v/v）乙醇中，以包被基质。包被35 mm培养皿时，将20 µL I型胶原加入1 mL 30%乙醇中。
3. 用溶液覆盖培养皿，等待溶液完全蒸发，敞口放置数小时。用无菌1×PBS洗涤3次；玻片即可用于细胞接种。
4. 在细胞摄取磁性纳米颗粒（MNP）后，重悬细胞，接种10⁵ 在35 mm培养皿中接种细胞，并加入2 mL分化培养基。将培养物置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育。
5. 24小时后，加入1:100的新鲜小鼠β-NGF（终浓度为50 ng/mL）。每2天更换一次分化培养基，并添加新鲜小鼠β-NGF。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔细胞培养板	FALCON	353846
96孔细胞培养板	SPL life sciences	30096
两性霉素B溶液	Biological Industries	03-028-1B
牛血清白蛋白（BSA）	Biological Industries	03-010-1B
细胞与组织培养瓶	Biofil	TCF002250	75.0 cm^2 250 mL 透气盖，未处理
细胞培养皿	Greiner Bio-One	627-160	35 mm
离心管	Biofil	CFT021500	50 mL
I型胶原蛋白	Corning Inc.	354236	大鼠尾部来源，浓度范围 3-4 mg/mL
一次性针头	KDL		23 G
一次性注射器	Medispo	1160227640	10 mL
供体马血清	Biological Industries	04-124-1A
70%乙醇	ROMICAL LTD	19-009102-80
无水乙醇（脱水）	Biolab-chemicals	52505
胎牛血清（FBS）	Biological Industries	04-127-1A
新鲜小鼠β-NGF	Peprotech	450-34
GMW C型框架电磁铁	Buckley systems LTD		3470, 45 mm
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1B
PBS 10x	hylabs	BP507/1LD
PC12细胞系	ATCC	CRL-1721
青霉素-链霉素-制霉菌素溶液	Biological Industries	03-032-1B
含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基	Biological Industries	01-100-1A