将人类胚胎干细胞分化为神经前体细胞

摘要

来源：Jeon, K. 等，利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）直接分化为神经前体细胞（NPCs）的方法，该过程无需使用饲养层细胞或任何中间步骤。通过选择性抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，可诱导hESCs分化为神经前体细胞（NPCs）。

方案

1. 人胚胎干细胞（hESC）专用基底膜基质包被培养板的制备

1. 在 4 °C 下缓慢融化适用于 hESC 的基底膜基质溶液（见材料表），至少 2–3 小时或过夜，以避免形成凝胶。
2. 为制备包被基底膜基质的培养板，用预冷的含 F12 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM+F12）将基质稀释至终浓度为 2%。充分混匀后，每孔加入 1 mL 稀释后的基质溶液，涂布 6 孔板的每个孔。
3. 将包被了基底膜基质的培养板在室温（RT）孵育至少 3 小时，或在 4 °C 过夜。
   注意： 包被了基底膜基质的培养板可在 4 °C 保存 1 周，之后去除基质溶液并使用培养板。

2. 将集落型人胚胎干细胞适应为单细胞人胚胎干细胞培养

1. 对于在基底膜基质上生长的无饲养层培养的H9（WA09）人胚胎干细胞（hESC）克隆型培养物，吸除孔中的培养基 （图1A）。
2. 用1 mL DPBS洗涤一次。每孔加入1 mL分散酶溶液（1 U/mL），在37 °C孵育20分钟。
3. 移除分散酶，用2 mL DMEM/F12轻柔洗涤细胞一次，吸除培养基，然后每孔加入2 mL DMEM/F12。
4. 通过轻柔吹打使克隆脱落，并转移至15 mL离心管中。
5. 在370 × g 条件下离心2分钟，吸除上清液。
6. 为将细胞沉淀解离为单细胞，每管加入2 mL细胞解离溶液（1×浓度，见材料表），在37 °C孵育10分钟。
7. 在370 × g 条件下离心2分钟，移除解离溶液。
8. 加入新鲜mTeSR1人胚胎干细胞培养基，通过轻柔吹打将细胞解离为单细胞。
9. 为使克隆型hESC适应单细胞型培养，将约1.5–2.0 × 10⁶个hESC接种至经基底膜基质包被的6孔板的每个孔中，每孔含2 mL添加10 μM ROCK抑制剂的mTeSR1培养基，培养24小时 （图1A）。
10. 24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR1培养基，继续培养3天，使hESC以单细胞形式生长。每天更换培养基。
11. 第4天，当细胞培养接近100%汇合时，用解离溶液将细胞解离，然后按照步骤2.6所述重新接种。
    注意：ROCK抑制剂可提高单细胞型hESC培养最初24小时内的细胞存活率。

3. 单细胞类型人胚胎干细胞向神经前体细胞的分化（图2）

1. 为诱导NPC分化，使用1 mL解离液（1x）将单细胞型hESC解离，并在37 °C下孵育10分钟。
2. 以370 x g离心细胞2分钟，弃去解离液上清；加入1 mL DMEM/F12，通过轻柔吹打重悬细胞。
3. 将细胞以2 x 10⁵ 个细胞/孔的密度接种至基底膜基质包被的6孔板中，每孔加入含10 μM ROCK抑制剂的2 mL mTeSR1培养基。
4. 24小时后，更换为神经诱导培养基（含1% B27（不含维生素A）的DMEM），并补充1 μM dorsomorphin和5 μM SB431542。
5. 在神经诱导的前4天内每隔一天换液一次，之后每天换液，直至第7天达到融合状态（图2B）。
   注意：（1）Dorsomorphin通过靶向ALK2、3、6受体抑制BMP通路，同时抑制AMPK；SB431542通过靶向ALK5、7抑制TGFβ/Activin通路。（2）该方案已在另一株ESC系（WA01）中验证，结果与WA09相似。（3）我们通常使用Matrigel作为基底膜基质，但细胞也可在Geltrex上培养并分化为NPC，结果非常相似，可通过多种NPC标志物的表达证实（图3D、E）。Geltrex的使用方法与Matrigel相同（见第1节）。

结果

图 1：将集落型人胚胎干细胞（hESCs）适应为单细胞型培养。（A）H9 型 hESCs 在涂有 2% 基底膜基质的培养皿上接种后不同时间点的单细胞培养代表性相差显微图像。左侧为低倍镜图像，右侧为高倍镜图像。最上方图板为集落型 hESCs 的代表性图像。其余图板显示在向单细胞型 hESCs 适应过程中不同时间点的培养代表性图像。比例尺 = 200 μm。（B）在单细胞培养条件下，于含 10 μM ROCK 抑制剂的 2% 基底膜基质包被培养板中监测 H9 hESCs 的生长曲线，前 24 小时内持续观察。（C,D）通过流式细胞术对集落型（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	康宁	3516
Accutase	创新细胞技术	AT104-500	细胞解离液
激活素A	R&D 系统	338-AC-050
B27 添加剂（-维生素 A）	赛默飞世尔科技	12587010
离心机	DAMON/ICE	428-6759
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	4110
Corning hESC-合格基质（Matrigel）	康宁	354277	基底膜基质（本实验方案大部分步骤中使用）
中性蛋白酶	Stemcell Technologies	7923
DMEM	赛默飞世尔科技	10569-010
DMEM/F12	赛默飞世尔科技	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
胎牛血清	Fisher Scientific	SH3007003HI
Geltrex基质	赛默飞世尔科技	A1569601	基底膜基质
GlutaMax	赛默飞世尔科技	35050061	谷氨酰胺补充剂，100倍浓缩液
H9（WA09）人胚胎干细胞系	WiCell	WA09
层粘连蛋白	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC 培养基
非必需氨基酸（NEAA）	赛默飞世尔科技	11140050
ROCK抑制剂	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614