制备成人人类大脑的游离脑片培养

摘要

来源：Fernandes, A., 等。成人人类大脑的短期自由漂浮脑片培养。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种制备成人人脑游离脑片培养物的技术。使用振动切片机从脑组织切片中制备薄切片，随后将这些切片悬浮于添加了生长因子的培养基中，以维持组织的活性。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 材料的灭菌

注意：所有材料和溶液在使用前必须灭菌。

1. 将所有手术器械和振动切片机切片材料（刀片夹具、样品台、缓冲液托盘）在干热灭菌器中于 180 °C 灭菌 4 小时。
2. 对温度敏感的材料或设备，采用紫外线或γ射线照射灭菌。
3. 培养基和溶液通过高压灭菌或经 0.22 µm 孔径滤膜过滤灭菌。

2. 溶液的配制

1. 准备 15–20 mL 运输溶液：50% v/v 的 Hank 平衡盐溶液（HBSS）pH 7.4，50% v/v 用于维持出生后及成年脑神经元的基礎培养基（材料表），添加 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、3 mg/mL 葡萄糖和 33 µg/mL 庆大霉素。
   注意：运输溶液在样本采集前必须冷藏并充氧（用碳氧混合气鼓泡）至少 20 分钟。
2. 准备 300 mL 切片溶液（在 HBSS 中添加 10 mM HEPES 和 3 mg/mL 葡萄糖），并在冷冻箱中冷却至刚开始形成晶体的温度。
3. 准备 20 mL 培养基：用于维持出生后及成年脑神经元的基礎培养基（材料表），添加 1% L-谷氨酰胺衍生物（材料表）、2% 神经细胞培养添加剂（材料表）、1% 青霉素/链霉素和 0.25 µg/mL 两性霉素 B。

3. 设置切片装置

注意：由于在手术室内进行样本采集的流程较为复杂，建议在同事协助下完成本实验方案。

1. 在装有加盐冰块的容器中，将切片液置于碳酰气混合物（95% O₂, 5% CO₂）持续通气条件下孵育至少20分钟，再投入使用。
2. 制备一块3%琼脂糖块（约2 cm × 2 cm × 2 cm），并用瞬干胶将其固定在振动切片机的样品盘上，以便在切片过程中为组织样本提供额外的机械支撑（图1E）。
3. 设置振动切片机的切片参数：切片厚度为200 µm，振动频率为100 Hz，切片速度为0.5–1.0 mm/s。
4. 将振动切片机的缓冲液托盘锁定至切片机底座，并加入冰块，以确保在加入切片液和样本前以及整个切片过程中保持低温状态。

4. 样本采集

注意： 在本方案中，人新皮质组织在手术室采集后被运送至实验室。

注意：处理人类样本时，应遵循机构制定的适当安全规程。

1. 设置运输装置（图1C），该装置包括：一个装有碳氧混合气体的便携式气瓶，连接至压力/流量阀，用于控制气体输出，并通过硅胶管将气体输出端连接至运输容器；运输容器通常为带有穿孔盖的50 mL锥形离心管，用于气体输入，内含运输溶液；以及用于运输过程中样品冷却的冰。
2. 立即采集并运送标本（图1B）至实验室。将标本浸入冰冷的运输溶液中（持续用碳氧混合气体鼓泡）。

5. 切片

1. 将样本转移至含有切片液的培养皿（100 mm × 20 mm）中，并使用精细的外科工具小心地尽可能去除样本中残留的脑膜（图1D）。
2. 根据实验设计所需的特定特征，选择最佳的样本取向，并使用24号手术刀片修整出一个平坦的表面，作为将样本粘附于样品盘上的基底。
3. 使用一次性塑料勺和精细的画笔从培养皿中取出组织片段，并用滤纸吸去多余的液体（通过毛细作用干燥，避免滤纸直接接触组织片段）。
4. 使用速干胶将组织固定在振动切片机的样品盘上，直至其牢固地粘附于盘面并与琼脂糖块接触（图1E）。
5. 将已正确固定组织的振动切片机样品盘放入盛有切片液的缓冲槽中，整个过程中切片液必须持续通气。
6. 将刀架固定到位，并确保剃刀刀片牢固安装。
7. 切片液必须同时覆盖样本和刀片，方可开始切片（图1F）。
8. 将样本切成200 µm厚的切片。
   注意： 尽管某些振动切片机可自动完成切片，但在过程中密切观察并微调切片速度有助于获得更高质量的切片。初始不规则的切片应弃去。
9. 将切片从缓冲槽转移至含有切片液的培养皿中，修剪松散边缘及多余的白质，使皮质与白质的比例约为70%皮质/30%白质。

6. 培养

注意： 此步骤需在层流柜内的无菌环境中进行。

1. 在24孔板中每孔加入600 µL培养基，在接种组织切片前于36 °C、5% CO₂条件下孵育至少20分钟。
2. 使用画笔将一个组织切片接种至每孔中（图1G）。
3. 若培养板中有未使用的孔，请向其中加入400 µL无菌水。
4. 将培养板置于36 °C、5% CO₂条件下孵育。
   注意：首次更换培养基的时间应在接种后8–16小时之间，具体取决于组织切片的大小。
5. 向先前配制的10 mL培养基中添加脑源性神经营养因子（BDNF），使其终浓度为50 ng/mL。
   注意：在最初的8–16小时内，每孔使用600 µL培养基进行孵育，以避免营养耗竭和酸化，因为此阶段培养基消耗速度较快。从下一步开始，每孔培养基体积调整为400 µL。
6. 从每孔中移除333 µL用过的培养基，并加入133 µL新鲜的含BDNF培养基。
7. 此后每隔24小时重复换液操作，每次更换三分之一的用过的培养基，补充等量的新鲜含BDNF培养基。

结果

图1：成年人大脑皮层组织的取样、运输、切片与培养。该操作流程始于手术室，通过颞叶切除术获取用于治疗药物难治性癫痫的大脑皮层组织（A，B）。(C) 组织样本（n = 1）立即转移至含有冰冻含氧运输培养基的离心管中（见下文）。(D) 在实验室中，使用精细的眼科镊子去除软脑膜。用滤纸吸除多余液体后，将组织样本用瞬干胶（E）固定于振动切片机的样品盘上，使白质面朝下，软脑膜面朝上。(F) 使用商用剃须刀片将样品切成200 µm厚的切片，用精细的画笔收集，并转移回培养皿中，进一步修剪多余的白质和松散末端（未显示），然后进行（G）铺板并以自由漂浮方式培养。(H) 脑片培养物可维持数天的活性，适用于多种实验方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539
过硫酸铵	Sigma	A3678-25G
两性霉素B	Gibco	15290-018
B27	Gibco	17504-044
BDNF	Sigma Aldrich	SRP3014
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906
葡萄糖	Merck	108337
Glutamax	Gibco	35050-061
Hank's 平衡盐溶液	Sigma Aldrich	H1387-10X1L
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
Neurobasal A	Gibco	10888-022
PBS 缓冲液 pH 7.2	Laborclin	590338
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P4333
仪器与材料
碳酰混合气（Carbogen 混合气）	White Martins		95% O2, 5% CO2
CO2 培养箱	New Brunswick Scientific	CO-24	切片孵育条件：5% CO2, 36ºC
塑料勺			甜点勺大小
剃刀刀片	Bic		镀铬铂金材质，用于振动切片机切片
手术刀片	Becton Dickinson (BD)	24号	用于组织切片；建议使用相同或更小尺寸
超级胶水（Loctite Super Bonder）	Henkel		成分：氰基丙烯酸乙酯；2-丙烯酸；6,6'-二叔丁基-2,2'-亚甲基双对甲酚；均聚物
振动切片机	Leica	14047235612 - VT1000S