从大鼠脑组织中分离和培养小胶质细胞的无血清培养基方法

摘要

来源：Collins, H. Y., 等. 在无血清培养基中分离与培养啮齿类动物小胶质细胞以促进其动态分支形态. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种从大鼠脑组织中分离和培养小胶质细胞的方法。该方法通过使用包被有特异性识别小胶质细胞的单克隆抗体的培养板，将小胶质细胞与其他神经元及非神经元细胞分离开来。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 准备用于CD11b免疫平皿筛选的培养皿（第0天）

注意：每1 - 2个幼年大鼠脑组织准备1个免疫盘分离培养皿。

1. 向一个15 cm培养皿中加入25 mL 50 mM Tris pH 9.5溶液。
2. 向培养皿中加入羊抗小鼠IgG（H+L链），使其终浓度为6 µg/mL。轻轻旋转培养皿使溶液均匀分布。
3. 在37 °C条件下孵育1–3小时。
4. 用含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲液（DPBS++）清洗培养皿三次，然后更换为含有1 µg/mL OX42抗体的铺板缓冲液。将培养皿置于室温水平面上过夜。

2. 组织采集（第1天）

注意：本方案应耗时约 3 - 4 小时。

1. 开始前，确保所有溶液均为无菌并置于冰上预冷。将所有器械置于冰上预冷，并在使用前用乙醇灭菌。
2. 按照相应的监管程序，通过二氧化碳窒息法处死一只幼年实验大鼠。
   注意：也可使用致死剂量的氯胺酮/赛拉嗪（24 mg/mL 氯胺酮、2.4 mg/mL 赛拉嗪，剂量为 100 - 200 µL）处死更年幼的动物。若动物年龄小于14天，则必须使用氯胺酮/赛拉嗪。若使用多只动物，应从一只动物中取出组织后立即放入预冷的含钙镁DPBS⁺⁺中并置于冰上，再继续处理下一只动物。
3. 捏住后肢足掌，确认动物完全无反应后方可继续操作。
4. 使用27½-G针头，以10 - 30 mL冰冻灌注缓冲液经心脏灌注动物，直至流出液变澄清。
   注意：灌注缓冲液体积根据动物的大小/年龄而有所不同。
5. 灌注完成后立即取下动物头部。从脊髓端进入，用解剖剪在两侧切断枕骨髁，注意不要损伤脑组织。两侧小心剪断后，沿一侧顶骨和额骨向鼻骨方向向上剪开。用镊子小心向后掀开颅骨顶部，迅速取出脑组织（或感兴趣的中枢神经系统结构），并放入预冷的含钙镁DPBS⁺⁺中置于冰上。
6. 对所有剩余动物重复上述步骤。
   注意：后续所有步骤均应在层流罩内于适当的无菌条件下进行。

3. 机械解离（第1天）

1. 在收集完所有脑组织后，将一个脑组织置于冰上的培养皿中，用预冷的解剖刀切成 1 mm³ 大小的组织块，转移至含有 5 - 7 mL 冰冷匀浆缓冲液的预冷玻璃匀浆器中。每次仅处理一个脑组织。
2. 使用松配合的玻璃匀浆器，以 10 - 20 次轻柔且不完全的冲程解离组织。注意不要直接在匀浆器底部压碎组织，而是推动组织通过研杵壁与匀浆器管壁之间的间隙进行解离。
3. 小心取出研杵，避免引入气泡。让未充分解离的组织块沉降至匀浆器底部，将上清液转移至新的预冷 50 mL 锥形管中。
4. 补充等体积的新鲜匀浆缓冲液，重复步骤 3.2 和 3.3，共进行 3 - 4 轮，或直至所有组织完全解离。对每个脑组织重复上述操作。

4. 髓鞘去除（第1天）

注意：对于 P12 以后的动物，需进行髓鞘去除以分离小胶质细胞。

1. 使用 25 mL 移液管测量 50 mL 圆底管中细胞悬液的体积，然后加入预冷的匀浆缓冲液，将总体积调整至 33.5 mL。
2. 向细胞悬液中加入 10 mL 髓鞘分离缓冲液（MSB），通过反复倒置管子充分混匀。最终 MSB 的浓度为 23%，总体积为 43.5 mL。
3. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，刹车设置为慢速。
   注意：离心机减速过程应持续约 1.5–2 分钟。此步骤将形成上层的髓鞘和死细胞碎片、略显浑浊的上清液，以及富含活细胞的小量沉淀。
4. 用移液管小心移除上层的髓鞘/碎片及上清液。在移除上层时需格外注意，尽可能彻底地去除。
5. 将细胞沉淀重悬于 12 mL 结合缓冲液中。轻柔吹打细胞悬液，以分散可能残留的细胞团块。

5. 免疫筛选（第1天）

1. 将细胞悬液通过70-µm细胞筛，以去除大块碎片或细胞团块。
2. 用DPBS++冲洗OX42包被的贴壁培养皿三次。每次冲洗之间切勿让培养皿完全干燥。
3. 倒掉最后一次DPBS++冲洗液，将过滤后的细胞悬液加入贴壁培养皿中。轻轻摇晃培养皿以均匀分布细胞，然后在室温下于水平面上孵育20分钟，使细胞贴附。孵育时间不得超过20分钟，否则细胞将难以从培养皿中回收。
4. 用DPBS++冲洗培养皿10次，以去除未贴壁的细胞。小胶质细胞会牢固地贴附在培养皿上，因此每次冲洗时应轻轻摇晃培养皿，确保去除其他非贴壁细胞。
5. 倒掉最后一次DPBS⁺⁺冲洗液，加入15 mL DPBS++和200 μL胰蛋白酶（1.25%储备液）。
6. 在37 °C、10% CO₂条件下孵育培养皿，时间不超过10分钟，以进行胰蛋白酶消化。
   注意：孵育时间不得超过10分钟，否则小胶质细胞将难以去除。
7. 胰蛋白酶消化10分钟后，小胶质细胞仍会附着在培养皿上。倒掉胰蛋白酶/DPBS⁺⁺溶液，用DPBS⁺⁺轻轻冲洗两次以去除胰蛋白酶，然后加入12 mL冰冻的微胶质细胞生长培养基（MGM）。
8. 将培养皿置于冰上2分钟，以帮助减弱细胞与基质之间的相互作用，并确保培养皿保持水平，防止其局部区域干燥。
9. 使用10 mL移液管和高速移液控制器剧烈吹打，以从培养皿中回收细胞。用移液管的液流在培养皿上画出16×16的网格，尽量去除所有细胞。
10. 在显微镜下以20倍放大观察细胞，确认细胞已从培养皿上脱落。在培养皿顶部标记仍有细胞附着的位置，并在这些区域重复吹打操作。
11. 收集细胞悬液，并将3–4 mL上清液分装至每个15 mL锥形管中。在4 °C条件下以500 × g离心15分钟，使用慢速刹车。
    注意：通过较小体积离心小胶质细胞可实现细胞的最大回收率。
12. 吸除上清液，每管保留0.5 mL MGM与细胞沉淀。
13. 将每个沉淀重悬于剩余的MGM中，并合并所有管中的细胞。
14. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
15. 根据实验需求，按照第6–7步所述方法接种细胞。
16. 在37 °C、10% CO₂条件下培养细胞。
    注意：细胞可在定期更换培养基的情况下培养长达3–4周，或在不更换培养基的情况下培养一周。

6. 包被组织培养板/盖玻片（第1天）

1. 在24孔阴阳离子涂层组织培养板的中心直接加入15 µL IV型胶原蛋白（具体信息见材料表），于37 °C、10% CO₂条件下孵育15分钟。
2. 使用血细胞计数板计数细胞后，用MGM将细胞稀释至2.3 x 10⁵/mL。吸除IV型胶原蛋白液滴，立即将15 µL细胞悬液接种至该液滴位置，使每点细胞数为3.5 x 10³个细胞/点。于37 °C、10% CO₂条件下孵育5–10分钟，使细胞贴壁，然后轻柔地向孔中加入500 µL经CO₂平衡的含TGF-β2/IL-34/胆固醇的生长培养基（TIC）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Douncing 缓冲液			配方：50 mL DPBS++ 中含 200 μL 的 0.4% DNaseI 备注：使用时需保持冰冻状态
铺板缓冲液			配方：DPBS++ 中含 2 mg/mL 牛奶固体来源的蛋白胨
小胶质细胞生长培养基 (MGM)			配方：DMEM/F12，含 100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、2 mM 谷氨酰胺、5 μg/mL N-乙酰半胱氨酸、5 μg/mL 胰岛素、100 μg/mL 去铁转铁蛋白和 100 ng/mL 亚硒酸钠 备注：使用冰冻的 MGM 将小胶质细胞从免疫铺板皿中分离。
IV 型胶原包被液			配方：含 2 μg/mL IV 型胶原的 MGM
髓鞘分离缓冲液			配方：9 mL Percoll PLUS，1 mL 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 10x PBS，9 μL 1 M CaCl2，5 μL 1 M MgCl2 备注：加入 CaCl2 和 MgCl2 后需充分混匀
胰蛋白酶	Sigma	T9935
DMEM/F12	Gibco	21041-02
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
DMEM（高糖）	Gibco	11960-044
IV 型胶原			重悬：PBS 中 200 μg/mL 使用浓度：1:100 储存：-80°C
鼠抗大鼠 CD11b 单克隆抗体（克隆 OX42）	Bio-Rad	MCA275R	铺板：1:1,000；染色：1:500
含 TGF-b2/IL-34/胆固醇的生长培养基 (TIC)			配方：MGM 中含人源 2 ng/mL TGF-b2、100 ng/mL 小鼠 IL-34、1.5 μg/mL 羊毛胆固醇、10 μg/mL 肝素硫酸、0.1 μg/mL 油酸和 0.001 μg/mL 神经酸 备注：务必在将培养基预热至 37 °C 后再加入胆固醇，且浓度不得超过 1.5 μg/mL，否则会析出。含胆固醇的培养基不得过滤。在加入细胞前，需用 10% CO2 平衡 TIC 培养基 30 分钟至 1 小时，以确保最佳 pH。
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Primaria 培养板	VWR	Cat# 62406-456
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS