采用NMDG保护性复苏法进行脑切片制备

摘要

来源：Ting, J. T. 等. 采用优化的N-甲基-D-葡萄糖胺保护性复苏法制备急性脑片. J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种采用基于N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）的保护性复苏方法制备脑切片的实验方案。将分离的脑组织在含有NMDG和HEPES的无钙人工脑脊液（aCSF）中孵育，以在切片过程中最大限度地减少神经元细胞的死亡和损伤。切片后将脑片置于aCSF中恢复，以重建细胞活性

方案

1. 脑组织解剖与切片

1. 将动物断头。使用解剖刀切开头部皮肤，暴露颅骨帽。
2. 使用精细的超剪剪除颅骨帽上方的皮肤，并在颅骨尾侧/腹侧基底部两侧做小的侧向切口。从颅骨尾侧/背侧开始，沿背侧中线向前（头侧方向）进行额外的浅层切割，注意不要损伤下方的大脑组织。在嗅球水平处，垂直于中线做最终的“T”形切口。
   注意：必须小心操作，确保不损伤目标脑区。尤其应注意，任何时候均不得对大脑本身施加压迫力。
3. 使用圆头镊子从头侧中线部位开始夹住颅骨，向尾侧外侧方向剥离。两侧重复此操作，以裂开并移除颅骨背侧半部，暴露大脑。轻轻将完整的大脑舀入盛有预冷NMDG-HEPES aCSF的烧杯中。让大脑均匀冷却约1分钟。
4. 使用大刮铲将大脑从烧杯中取出，置于铺有滤纸的培养皿上。根据所需的切片角度和目标脑区，修剪并修整脑组织。操作应迅速，以避免在操作过程中长时间缺氧。
   注意：可采用多种切片角度。具体的修块方法和切片角度取决于所研究的特定脑区、细胞类型及神经环路。
5. 使用粘合胶将脑组织块固定在样品托上。将样品托的内芯部分回缩，使脑组织块完全收入其中。将熔化的琼脂糖直接倒入样品托中，直至完全覆盖脑组织块。将预冷的辅助冷却块夹紧在样品托周围约10秒，直至琼脂糖完全凝固。
6. 将样品托插入切片机的插槽中，并确认对位正确。用250 mL烧杯中剩余的预冷且充氧的NMDG-HEPES aCSF填充储液槽，并将气泡石放入储液槽中，持续供氧以保证切片过程中的充分氧合。
7. 调节微米计，开始推进包埋在琼脂糖中的脑组织样本。启动切片机，并根据经验将推进速度和振荡频率调节至理想水平。
   注意：两个参数均应设置在较低范围内。为获得最佳效果，刀臂单次切割过程应持续约20秒，振荡应产生非常平滑且轻柔的嗡鸣声，不应出现明显的嗡嗡声。
8. 以300 µm（或其他设定厚度）为步进继续推进并切片，直至目标脑区被完全切完；整个切片过程总时间应少于15分钟。

2. 优化的NMDG保护性复苏程序

1. 初始NMDG恢复步骤（关键步骤）：切片完成后，使用截断的塑料巴斯德吸管收集所有切片，并迅速转移至含有150 mL NMDG-HEPES aCSF的预热（34 °C）初始恢复室中。将所有切片快速连续转移，并在所有切片进入恢复室后立即启动计时器。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Compresstome VF-200	Precisionary Instruments	VF-200	振动式组织切片机（推荐）
N-methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004	aCSF 成分
氯化钠	Sigma Aldrich	S3014	aCSF 成分
氯化钾	Sigma Aldrich	P5405	aCSF 成分
一水合磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	71505	aCSF 成分
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761	aCSF 成分
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	aCSF 成分
葡萄糖	Sigma Aldrich	G7021	aCSF 成分
抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	A4034	aCSF 成分
硫脲	Sigma Aldrich	T8656	aCSF 成分
丙酮酸钠	Sigma Aldrich	P5280	aCSF 成分
二水合氯化钙	Sigma Aldrich	C7902	aCSF 成分
七水合硫酸镁	Sigma Aldrich	M1880	aCSF 成分
弯头钝头镊	Fine Science Tools	11065-07	脑组织解剖工具
精细解剖剪（超锐）	Fine Science Tools	14058-09	脑组织解剖工具
大型重型剪刀 7英寸	Fine Science Tools	14000-18	脑组织解剖工具
金属刮刀	Sigma Aldrich	Z511455-1PAK	脑组织解剖工具
剃须刀片	VWR	89031-954	脑组织解剖工具
Brain Slice Keeper-4	Automate Scientific	S-BSK4	脑片保存室
尼龙网	Warner Instruments	64-0198	用于构建小型脑片恢复室
Pyrex 玻璃烧杯（250 mL）	VWR	89090-434	用于构建小型脑片恢复室
35 mm 塑料培养皿，圆形	VWR	100488-376	用于构建小型脑片恢复室
气体扩散石（10 µm）	Sigma Aldrich	59277	用于持续通入碳合气（产生细小气泡）
琼脂糖 I-B 型	Sigma Aldrich	A0576	用于包埋脑组织样本
盐酸	Sigma Aldrich	H1758-100ML	用于调节培养基 pH
氢氧化钠	Sigma Aldrich	221465-25G	用于调节培养基 pH
氢氧化钾	Sigma Aldrich	221473	用于调节培养基 pH
3 mL 带刻度塑料移液管	VWR	89497-676	用于转移脑片
氧化锆陶瓷注射刀片	Cadence Specialty Blades	EF-INZ10	http://cadenceinc.com/
加热水浴锅（2.5L）	VWR	13491-060	其他
圆形滤纸	VWR	28456-022	其他
氰基丙烯酸酯胶	Amazon	B000BQRBO6	其他
玻璃培养皿	VWR	89000-326	其他
10X 磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P5493	其他
恒温混匀仪（配 1.5 mL 管模块）	VWR	89232-908	用于保持琼脂糖处于熔融状态