使用基于 NMDG 的保护性恢复方法制备脑切片

摘要

来源:Ting， J. T. et al. 使用优化的 N-甲基-D-葡糖胺保护性恢复方法制备急性脑切片。 J. Vis. Exp. （2018 年）。

该视频描述了使用基于 N-甲基-D-葡糖胺 （NMDG） 的保护性恢复方法获得脑切片的方案。将解剖的大脑与 NMDG 和 HEPES 一起在 aCSF 中孵育，以最大限度地减少切片过程中的神经元细胞死亡和损伤。允许在 aCSF 中恢复该部分以恢复细胞活动

方案

1. 脑解剖和切片

1. 斩首动物。用手术刀打开头部的皮肤，露出颅骨帽。
2. 使用细的超剪剪刀切掉颅骨帽上的皮肤，并在颅骨尾部/腹侧基部的两侧横向做小切口。从颅骨的尾部/背侧开始，沿着背中线的喙部向上移动，注意不要损伤下面的大脑。在嗅球水平处垂直于中线进行最后的 "T "形切割。
   注意:必须注意确保不会对感兴趣的大脑区域造成损害。特别是，任何时候都不应对大脑本身施加任何压缩力。
3. 使用圆尖镊子抓住颅骨，从头骨-内侧开始，然后向尾外侧方向剥离。重复上述步骤，让两侧裂开并去除颅骨帽的背半部分，露出大脑。轻轻地将完整的大脑舀入预冷的 NMDG-HEPES aCSF 的烧杯中。让大脑均匀冷却 ~1 分钟。
4. 用大抹刀将大脑从烧杯中取出，放到覆盖有滤纸的培养皿上。根据首选的切片角度和所需的感兴趣大脑区域修剪和封闭大脑。快速工作以避免在处理过程中长时间缺氧。
   注意:许多切片角度都是可能的。确切的阻断方法和切片角度将取决于要研究的确切大脑区域、细胞类型和电路。
5. 使用胶水将脑块固定在标本架上。将标本架的内件缩回足以将脑阻滞完全拉入内部。将熔融的琼脂糖直接倒入支架中，直到脑块完全被琼脂糖覆盖。将预冷的附件冷却块夹在样品架周围 ~10 秒，直到琼脂糖凝固。
6. 将样品架插入切片机上的插座中，并验证是否正确对齐。用 250 mL 烧杯中剩余的预冷含氧 NMDG-HEPES aCSF 填充储液槽，并在切片期间将气泡石移入储液槽中，以确保足够的氧合。
7. 调整千分尺以开始推进琼脂糖包埋的脑标本。启动切片机并凭经验将前进速度和振荡频率调整到所需的水平。
   注意:这两个设置都应在较低范围内。为获得最佳效果，刀片臂的一次通过大约需要 20 秒，振荡应产生非常平滑和柔和的嗡嗡声，没有明显的嗡嗡声。
8. 继续以 300 μm 的增量（或其他首选厚度）推进和切片组织，直到感兴趣的大脑区域被完全切片;切片过程的总时间应少于 15 分钟。

2. 优化的 NMDG 保护性恢复程序

1. 初始 NMDG 恢复步骤（关键步骤）:完成切片程序后，使用切断的塑料巴斯德移液管收集所有切片，并将它们转移到装有 150 mL NMDG-HEPES aCSF 的预热 （34 °C） 初始恢复室中。在短时间内连续转移所有切片，并在所有切片进入恢复室后立即启动计时器。

材料