一种延长视网膜神经组织孵育时间的技术

摘要

来源：Cameron, M. A., 等。用于电生理学与钙成像的急性神经组织的延长孵育。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种对视网膜神经组织进行长期孵育的方法。从鼠眼获取含有视网膜的视杯；通过酶消化内界膜（ILM），以暴露视网膜的神经细胞，随后将处理后的视杯或分离的视网膜转移至专用孵育器中，在低温条件下进行长期孵育。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 视网膜铺片制备与内界膜去除

1. 在常规实验室光照条件下或弱红光/红外光下制备视网膜全层铺片。
2. 通过颈椎脱位法处死动物，并立即摘除眼球。沿锯齿缘做一小切口，将眼球置于Ames培养基或人工脑脊液（aCSF）中，aCSF成分（mM）如下：125 NaCl、25 NaHCO₃、3 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、10 葡萄糖、0.5 L-谷氨酰胺，并用碳合气（95% O₂/5% CO₂混合气体）饱和（约300 mOsm；pH 7.4），室温（RT）保存。
3. 使用小剪刀沿锯齿缘剪开，用镊子迅速去除角膜、晶状体和玻璃体。将组织置于孵育系统中，于室温（RT）下保存。
   注意：视网膜组织可在眼杯中保存，在缓慢降温至15–16 °C后，可在孵育系统中维持超过>24小时，直至使用。
4. 为去除内界膜（ILM），将含有视网膜的眼杯转移至含30 U/mL木瓜蛋白酶、1 mM L-半胱氨酸、0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.005%脱氧核糖核酸酶（DNase）的Earl's平衡盐溶液（BSS）的小玻璃瓶中，37 °C孵育20分钟。通过瓶盖向溶液通入95% O₂/5% CO₂气体，但不产生气泡。若使用幼龄动物（<6周）的组织，需将酶液稀释至一半浓度。
   1. 将组织转移至含卵黏蛋白（10 mg/mL）和牛血清白蛋白（BSA，10 mg/mL）的Earl's BSS溶液中孵育10分钟，以终止酶消化反应。在转移至孵育系统前，用aCSF充分清洗组织，并将温度降至15–16 °C。
5. 视网膜组织可保留在眼杯中直至使用。转移至显微镜前，将视网膜从眼杯中分离，并用刀片切成4片。如需完整视网膜，可在视网膜周边做四个小切口，使其平铺。
   注意：进行成像实验时，应在转移至孵育系统前加载钙敏感染料，详见下文。

2. 在培养箱中维持组织活性

1. 将组织置于主腔室中，该腔室内含有用于测量 pH 和温度的探针（图 1A、B）。
2. 使人工脑脊液（aCSF）流经第二个腔室（UVC 腔室，结构如前所述），该腔室与主腔室隔离，并暴露于 1.1 W 的紫外 C 波段（UVC）光（254 nm，5W/2P 灭菌用紫外灯）下，以清除溶液中漂浮的细菌（图 1A）。通过可编程定时器控制 UVC 光照时间，使用随机功能使光照在每 15 至 30 分钟内于 15 至 26 分钟之间的不同时间点开启，以避免 aCSF 过度加热。
3. 将 UVC 腔室的流速设定为 12 mL/min，方法如前所述。用铝箔覆盖 UVC 腔室，以防止 UVC 光线泄漏至腔室外，从而避免对神经组织造成损伤。
   注意：对于暗适应的视网膜组织，应使用自制遮光罩覆盖主腔室，以隔绝光线。
4. 使用蠕动泵使溶液（aCSF）在两个腔室之间循环，并利用帕尔贴热电制冷片冷却器对主腔室进行冷却或加热，使其温度达到 0 - 50 °C 范围内的目标值。为获得最佳组织孵育效果，长期维持组织活性时建议使用 15 - 16 °C。

结果

图1. 一种可精确调控组织环境的孵育系统。A， 孵育系统的示意图，由制冷帕尔贴板、主腔室、蠕动泵和UVC腔室组成。B，主腔室的侧视图，显示人工脑脊液（aCSF）的入口和出口位置，以及碳合气（carbogen）入口、温度和pH探针。脑片按图示置于网格上。所有测量探针均固定在盖子上，以确保结构稳定性。C，aCSF参数记录图，显示孵育过程中aCSF的温度和pH值变化情况。D，主腔室的俯视图，显示用于固定测量探针的安装孔。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma Aldrich VETEC	V800372
氯化钾	Sigma Aldrich	P9333
N-甲基-D-葡糖胺	Sigma Aldrich	M2004
D-葡萄糖	Sigma Aldrich	G5767
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S6014
氯化镁	Sigma Aldrich	M9272
氯化钙	Sigma Aldrich	223506
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington	LK003150
固定式直立显微镜	Olympus	BX51WI
显微镜物镜	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
显微镜物镜	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
帕尔贴半导体制冷板冷却器	TE Technology	CP-121
温度控制器	TE Technology	TC-36-25 RS232