从小鼠胼胝下区分离与培养成年神经干细胞

摘要

来源：Kim, J. Y., 等. 从小鼠胼胝下区分离并培养成年神经干细胞。 J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了从小鼠大脑胼胝下区分离和培养神经干细胞的过程。该过程包括组织解剖、酶解离散，以及在分化因子作用下进行培养，以发育为成熟的神经细胞。

方案

1. 材料与培养基的准备

1. 为进行扣带回下区（SCZ）的解剖与解离，将脑切片模具、双刃剃须刀片和镊子用铝箔包裹，然后通过高压灭菌进行消毒。
2. 准备 50 ml 冷的 PBS（磷酸盐缓冲液）缓冲液，用于清洗整只小鼠脑组织。
3. 设置解剖显微镜，并准备好脑组织解剖所需的手术器械（已灭菌的剪刀和镊子）以及分离 SCZ 所需的工具（1 ml 注射器、30 G 针头、脑切片模具和精细镊子）。
4. 制备 N2 培养基：
   1. 使用 F-12/DMEM（含 L-谷氨酰胺、碳酸氢钠）培养基，添加 2% B27、1% N2 补充剂和 1% 青霉素-链霉素。
      注意：生长培养基由 N2 培养基和生长因子组成（20 ng/mL 纯化的表皮生长因子（EGF）和 20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF2））。
5. 制备消化缓冲液（含 40 unit/ml 木瓜蛋白酶、2.4 unit/ml 中性蛋白酶 II 和 2% 青霉素-链霉素的 PBS 溶液），用于组织消化。
6. 包被培养板与盖玻片的制备：
   1. 配制聚-L-鸟氨酸（PLO；0.01%）和层粘连蛋白（laminin；10 µg/ml，溶于 DH₂O 中）。为包被 6 孔板（用于单层维持成年神经干细胞 SCZ-aNSCs）或 18 mm 盖玻片（用于免疫染色），将板或盖玻片在 4°C 下与....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Gibco	11320-033	L-谷氨酰胺，碳酸氢钠
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Invitrogen	15140-122
N2 添加剂	Gibco	17502-048
B27 添加剂	Gibco	17504-044
bFGF	R&D	233-FB
EGF	Gibco	PHG0313
PBS (10X)	BIOSOLUTION	BP007a	1X 稀释
HBSS	Gibco	14175-095
Dispase II	Roche	04-942-078-001
木瓜蛋白酶（Papain）	Worthington	3126
Accutase	ICT	AT-104
精细镊子	WPI	555229F
剪刀	Storz	E3321-C
脑组织切片模具（1 mm）	RWD	68707
双刃剃刀	DORCO	ST-300
30 号针头	SUNGSHIM	N1300
15 ml 离心管	SPL	50015
50 ml 离心管	SPL	50050
35 mm 培养皿	SPL	10035	培养皿
100 mm 培养皿	SPL	10090	培养皿
盖玻片（18 mm）	Deckglaser	111580
12 孔板	SPL	32012	非包被
6 孔板	SPL	32006	非包被
PLO	Sigma	P4957	0.01%
层粘连蛋白（Laminin）	Gibco	23017-015	10 mg/ml
Nestin	Millipore	MAB353	小鼠（1:1000）
BrdU	Abcam	ab6326	大鼠（1:500）
青霉素（Penicillin）
链霉素（Streptomycin）
解剖显微镜
离心机
P1000 移液器
水浴锅
CO2 培养箱
台盼蓝（Trypan blue）
血细胞计数板（hematocytometer）