从小鼠胼胝下区分离与培养成年神经干细胞

摘要

来源：Kim, J. Y., 等. 从小鼠胼胝下区分离并培养成年神经干细胞。 J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了从小鼠大脑胼胝下区分离和培养神经干细胞的过程。该过程包括组织解剖、酶解离散，以及在分化因子作用下进行培养，以发育为成熟的神经细胞。

方案

1. 材料与培养基的准备

1. 为进行扣带回下区（SCZ）的解剖与解离，将脑切片模具、双刃剃须刀片和镊子用铝箔包裹，然后通过高压灭菌进行消毒。
2. 准备 50 ml 冷的 PBS（磷酸盐缓冲液）缓冲液，用于清洗整只小鼠脑组织。
3. 设置解剖显微镜，并准备好脑组织解剖所需的手术器械（已灭菌的剪刀和镊子）以及分离 SCZ 所需的工具（1 ml 注射器、30 G 针头、脑切片模具和精细镊子）。
4. 制备 N2 培养基：
   1. 使用 F-12/DMEM（含 L-谷氨酰胺、碳酸氢钠）培养基，添加 2% B27、1% N2 补充剂和 1% 青霉素-链霉素。
      注意：生长培养基由 N2 培养基和生长因子组成（20 ng/mL 纯化的表皮生长因子（EGF）和 20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF2））。
5. 制备消化缓冲液（含 40 unit/ml 木瓜蛋白酶、2.4 unit/ml 中性蛋白酶 II 和 2% 青霉素-链霉素的 PBS 溶液），用于组织消化。
6. 包被培养板与盖玻片的制备：
   1. 配制聚-L-鸟氨酸（PLO；0.01%）和层粘连蛋白（laminin；10 µg/ml，溶于 DH₂O 中）。为包被 6 孔板（用于单层维持成年神经干细胞 SCZ-aNSCs）或 18 mm 盖玻片（用于免疫染色），将板或盖玻片在 4°C 下与 PLO 孵育过夜。随后用 DH₂O 洗涤 3 次。最后一次洗涤后让培养板和盖玻片自然干燥。
   2. 接着，在 4 °C 下用层粘连蛋白孵育培养板过夜，然后用 DH₂O 洗涤 3 次。
      注意：切勿使包被有层粘连蛋白的表面干燥，否则会影响细胞贴附。
      说明：包被溶液可重复使用 3 次。

2. 成年SCZ的分离与解离

1. 在准备培养前，将脑切片模具和双刃剃刀置于冰上。
   注意：切勿将脑切片模具冷冻，否则脑组织可能粘附其上。
2. 通过 CO₂ 窒息法或颈椎脱臼法处死一只小鼠（8周龄）。
   1. 喷洒70%乙醇后，用锋利的剪刀剪下头部。为固定头部，需紧紧握住头部两侧。沿中线从尾侧向头侧方向剪开皮肤，以利于完整剥离颅骨上的皮肤。
   2. 首先移除颅骨的尾侧部分（λ点后方），然后将镊子插入背侧中线位置的颅骨与脑组织之间。夹住左侧（或右侧）顶骨，小心将其剥离。重复此操作以移除另一侧顶骨。
      注意：切断视神经并去除脑膜有助于更顺利地将脑组织从颅骨中分离。
   3. 将脑组织转移至25 ml冷PBS缓冲液中，冲洗两次以去除多余血液。
3. 将脑组织放入置于冰上的脑切片模具中，进行冠状面切割，获得厚度为1 mm的脑片。将包含位于脑后部SCZ区域的脑片（1 mm）转移至盛有冷PBS的35 mm塑料培养皿中。
   注意：为获得平行的冠状切面，必须确保脑裂位于脑切片模具的中线上；这是避免切片出现不必要的变异的关键。
   注意：应获取位于前囟后方2–3 mm处的脑片，以便将SCZ与侧脑室下区（SVZ，subventricular zone）分离。
4. 在低倍解剖显微镜下，使用弯头30G针头从皮层和海马的白质区域显微解剖分离SCZ区域6,9。随后去除SCZ上方的皮层组织。将分离出的SCZ组织片放入置于冰上但不含冷PBS的35 mm塑料培养皿中。
   注意：若混入含有成熟神经元的其他区域组织，可能会影响aNSCs的存活率及神经球的形成，因为这些成熟细胞在aNSC培养条件下会发生细胞死亡。
5. 使用弯头30 G针头立即把分离的组织切成小块。
   注意：若SCZ组织的分离过程需要较长时间，应在切割前将已分离的组织浸入冷PBS中保存。
6. 用1 ml消化缓冲液重悬切碎的组织，转移至含有2 ml消化缓冲液的15 ml离心管中，在37°C水浴中孵育30分钟。
   注意：每10分钟轻轻振荡离心管一次，以确保充分混匀。

3. 扣带回下区来源的成体神经干细胞培养

1. 轻轻敲击离心管以解离消化后的组织，然后在145 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用1 mL预热的N2培养基重悬消化后的组织以洗去消化液，并使用P1000移液器轻柔吹打样品溶液最多5次。
   注意：使用过细的移液枪头过度吹打会降低细胞活力及后续生长能力。
2. 在145 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，用1 mL N2培养基重悬细胞沉淀。
3. 在未包被的6孔板中每孔加入1 mL N2培养基，再加入1 mL细胞悬液，使终体积为2 mL。
4. 向每孔中加入EGF（20 ng/mL）和bFGF（20 ng/mL）。用手轻轻晃动6孔培养板，使添加的生长因子与接种的细胞充分混匀。将6孔板置于37°C、5% CO₂的培养箱中培养。
5. 每天向每孔中添加EGF（20 ng/mL）和bFGF（20 ng/mL），持续8天。每三天添加200 µL N2培养基，以维持培养基总体积约2 mL。

4. 神经干细胞神经球的传代及单层培养

1. 收集神经球并转移至新的15 ml锥形管中。
   注意：单个小鼠脑部SCZ区每孔产生的神经球数量（直径>50 µm）为64.3 ± 7.31，低于SVZ区（190.5 ± 6.33）。
2. 将神经球与0.5 ml解离缓冲液在37°C水浴中孵育5分钟，使其解离为单细胞。原代神经球可被解离为单细胞，并可在多代传代中以神经球或单层培养形式维持。
   注意：以单层形式扩增SCZ-aNSCs优于神经球形式，因为SCZ-aNSCs在单层培养体系中可传代>10次，而在神经球培养体系中仅能传代<5次。
   注意：SCZ-aNSCs具有强烈的聚集倾向，难以有效解离为单细胞。因此，不建议采用神经球培养形式进行常规细胞扩增。
3. 使用P1000移液器轻轻吹打样品溶液上下混合不超过5次，然后以145 × g离心5分钟。弃去上清液，并用1 ml N2培养基重悬神经球。
   注意：使用窄口移液枪头过度吹打会降低细胞活力及后续生长能力。
4. 为进行细胞计数，取10 µl细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按1:1比例混合，随后在血细胞计数板上计数活细胞数量。将6孔板用PLO/层粘连蛋白包被后，每孔加入2 ml N2培养基，以2.5 × 10⁵ 个细胞/ml的密度接种细胞。
   注意：细胞密度的变化可能影响其状态和分化潜能。
5. 使用生长因子（2 ml，20 ng/ml）每日处理，持续培养5天后进行传代。

5. 胼胝体下区来源的成体神经干细胞的分化

1. 将aNSCs以每毫升1 × 10⁵个细胞的密度接种于经PLO/层粘连蛋白包被的18 mm盖玻片上，加入含生长因子（20 ng/ml）的1 ml N2培养基，用于SCZ-aNSCs的分化。
2. 次日，当细胞已牢固贴附于盖玻片时，更换培养基为不含生长因子的N2培养基。
3. 6天后，用1 ml PBS洗涤已分化的细胞以去除细胞碎片，并进行固定以用于免疫染色。
   注意：BrdU可掺入增殖细胞新合成的DNA中。因此，如需要，可在细胞固定前将BrdU（10 µg/ml）加入活细胞中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Gibco	11320-033	L-谷氨酰胺，碳酸氢钠
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Invitrogen	15140-122
N2 添加剂	Gibco	17502-048
B27 添加剂	Gibco	17504-044
bFGF	R&D	233-FB
EGF	Gibco	PHG0313
PBS (10X)	BIOSOLUTION	BP007a	1X 稀释
HBSS	Gibco	14175-095
Dispase II	Roche	04-942-078-001
木瓜蛋白酶（Papain）	Worthington	3126
Accutase	ICT	AT-104
精细镊子	WPI	555229F
剪刀	Storz	E3321-C
脑组织切片模具（1 mm）	RWD	68707
双刃剃刀	DORCO	ST-300
30 号针头	SUNGSHIM	N1300
15 ml 离心管	SPL	50015
50 ml 离心管	SPL	50050
35 mm 培养皿	SPL	10035	培养皿
100 mm 培养皿	SPL	10090	培养皿
盖玻片（18 mm）	Deckglaser	111580
12 孔板	SPL	32012	非包被
6 孔板	SPL	32006	非包被
PLO	Sigma	P4957	0.01%
层粘连蛋白（Laminin）	Gibco	23017-015	10 mg/ml
Nestin	Millipore	MAB353	小鼠（1:1000）
BrdU	Abcam	ab6326	大鼠（1:500）
青霉素（Penicillin）
链霉素（Streptomycin）
解剖显微镜
离心机
P1000 移液器
水浴锅
CO2 培养箱
台盼蓝（Trypan blue）
血细胞计数板（hematocytometer）