建立牙髓细胞与三叉神经元的共培养体系以实现交互通讯

摘要

来源：Barkley, C. 等，一种共培养方法用于研究神经突在牙髓旁分泌信号作用下的生长。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种利用Transwell小室建立三叉神经元与原代牙髓细胞共培养的技术。在这种物理分离的条件下，从牙髓组织中获得的间充质细胞会分泌旁分泌信号分子，这些分子可通过小室的孔隙穿过，促进神经元向间充质细胞方向分化和迁移，从而建立共培养系统。

方案

1. 培养板准备

注意：在无菌细胞培养操作台外进行所有孵育和洗涤步骤时，务必盖上培养板盖子，以防止样品处理过程中发生污染。

1. 包被滤膜
   1. 将层粘连蛋白（laminin）稀释至 10 μg/mL。在超净台中对稀释后的层粘连蛋白进行过滤。
   2. 用移液器将 450–500 μL 的 10 μg/mL 层粘连蛋白加入 24 孔板的每个孔中。
   3. 将孔径为 3 μm 的 transwell 滤膜放入孔中，使其接触层粘连蛋白溶液，并置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时或过夜。滤膜的孔隙应允许部分溶液渗透，从而使滤膜的上、下表面均被包被。这些滤膜应在 48 小时内使用，或在 4 °C 冰箱中冷藏保存，最长可保存 1 周。

2. 细胞接种

1. 小鼠：可对牙髓（DP）细胞进行遗传修饰（但非必需），以研究间充质-神经元相互作用。
2. DP解剖、分散与接种（图1）
   注意：进行牙乳头（DP）解剖时，使用超细直头镊子。超细的镊尖边缘可使操作者将镊子尖端插入矿化结构与牙乳头组织之间。
   1. 收获 P5-P8 阶段小鼠。在此阶段，牙齿应处于矿化过程中，且根部开放。
   2. 通过低温麻醉法将新生小鼠置于4 °C冰箱中的培养皿内，直至其不再移动或对触碰无反应。按照机构动物护理和使用委员会的规定，通过断头法处死新生小鼠。 & 使用委员会（IACUC）在指定机构的规程。
   3. 在50 mL锥形管中准备3–5 mL的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）分装液，用于收集每只小鼠的牙髓组织（DP）。这有助于消化新生后小鼠的牙髓组织。若需消化超过10只新生后小鼠的组织，则使用超过3 mL的消化液。
   4. 将头部置于一次性垫巾上，使口腔朝向天花板，颈部基部平放于操作台面。使用剃须刀片以锯切动作分离下颌骨与上颌骨。
   5. 可选择使用剪刀或镊子移除舌头，以便更方便地接触到磨牙。
   6. 将打开的头部置于铺有无菌纱布垫的培养皿中，并将样本置于解剖显微镜下图1D).
   7. 去除第一磨牙周围牙槽骨组织。此时下颌牙齿尚未完全萌出。将牙钳插入牙槽开口，从牙齿表面向颊侧（脸颊）或舌侧（舌头）方向分离并移除周围组织。上颌牙齿则需完全去除牙齿周围的裂隙组织，以暴露并拔除牙齿。
   8. 将下颌和上颌第一磨牙（M1）轻柔转移至另一含有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的细胞培养皿中。
   9. 重复步骤2.2.4–2.2.8，直至收集完所有M1。在收获过程中，将含有M1的培养皿置于冰上。
   10. 去除围绕每颗第一磨牙（M1）外侧的釉质外器官（EOE）。此步骤也可在步骤 2.2.11 之后进行。
   11. 用镊子将M1牙齿旋转，使牙尖朝下，暴露敞开的牙根。牙齿底部会有一个椭圆形开口，其内有不透明的牙髓组织，外包一层薄薄的牙本质和釉质。
   12. 用镊子的尖端轻轻松动牙乳头，将镊子的一臂沿矿化组织内部周缘移动。将牙乳头组织从矿化结构中取出，并转移至第三个含有1x PBS的培养皿中。若上皮根鞘尚未分离，则将其移除。图1E).
   13. 将所有DP组织转移至含有0.25%胰蛋白酶-EDTA的50 mL锥形管中。涡旋混匀后，置于37 °C水浴中孵育10 min。可使用同一把镊子或长柄瓶用镊子进行操作。组织较难分散，需每3–4 min涡旋一次。胰蛋白酶消化时间不得超过10 min，以免胰蛋白酶损伤细胞膜。
   14. 在无菌操作台中，加入预热的共培养培养基（表1) 至少按1:1的培养基与胰蛋白酶比例加入，以灭活酶活性。若需更强的组织分散效果，可使用更大的比例。
   15. 用10 mL移液管将培养基上下吹打数次，以进一步分散培养基中的DP组织。注意避免产生大气泡。由于组织具有黏性，完全分散几乎不可能，但亦无此必要，因为细胞在接种后会从组织块向外迁移。
   16. 将1 mL分散的DP转移至24孔组织培养板的每孔中（图1F).
   17. 将培养板置于37 °C培养箱中，孵育48小时，使细胞贴壁并从未分散的组织中迁移出来，然后更换培养基。原代细胞需要以相对较高的浓度接种，以便在1周内达到85–90%的融合度。若1周后未达到该融合度，则弃用该培养板。
3. 三叉神经元的分离、分散与接种
   注意在本实验方案中，使用青春期（6周龄）B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J小鼠与DP细胞共培养，优化了神经突起生长的成像效果。Thy1-YFP小鼠的中枢和周围神经系统表达黄色荧光蛋白（YFP）标签，该蛋白在出生后第6至第10天（P6-P10）左右开始在神经元中表达，并在出生后及成年期间于整个神经系统中呈指数级增加。YFP与GFP具有保守序列，使得这些神经可被抗GFP抗体标记，从而实现全神经元染色。最终，此类小鼠有助于在细胞培养中更清晰地观察和定量分析所用及生长的神经元。
   1. 用二氧化碳安乐死 adolescent 小鼠，随后进行颈椎脱位。
   2. 处死小鼠并剥离颅骨上的皮肤。确保雄性和雌性小鼠数量相等。
   3. 将显微解剖剪的尖端插入颅底。沿颅骨的矢状缝剪开图1A).
   4. 在颅骨两侧耳部附近的冠状缝处，以及颅底人字缝处各做两个小的水平切口，共四个。这将形成两块骨瓣。
   5. 用镊子掀开两片骨瓣，即可暴露脑组织。
   6. 取出脑组织。将头部转移至含有1×PBS的组织培养皿中，并置于显微镜下。
   7. 定位三叉神经节（TG），该结构在啮齿类动物中易于观察¹³，位于上颌突的脑与骨之间的硬脑膜内（图1B).
   8. 用直头精细镊子剪断通向眼睛、上颌和下颌的三条分支，并将神经节转移至冰冷的1×PBS中。采集过程中，将盛有三叉神经节的培养皿置于冰上。
   9. 待所有三叉神经节束收获后，使用瓶钳将神经节转移至含有5 mg/mL经无菌过滤的II型胶原酶的50 mL锥形管中。
   10. 将胶原酶与TG组织束涡旋混匀，将离心管置于37 °C水浴中孵育25–30分钟。在此期间，每隔5–10分钟将锥形管从水浴中取出，涡旋震荡后重新放回水浴。
   11. 将胶原酶-TG神经元溶液以643 × g离心2分钟 g.
   12. 在组织培养罩内，用微量移液器轻柔地吸出胶原酶。
   13. 加入5 mL经0.22 μm滤器灭菌的1% II型胰蛋白酶溶液，涡旋混匀。将锥形管置于37 °C水浴中孵育5分钟。
   14. 将胰蛋白酶-TG 混合液在 643 × g 条件下离心 5 分钟 g用移液枪小心吸除上层胰蛋白酶溶液，避免吸出三叉神经节神经元。此时离心管中仍会留有部分液体。
   15. 加入足够的培养基以灭活残留的胰蛋白酶（胰蛋白酶与培养基的比例为1:1或更低）。
   16. 计数细胞数量，并将溶液稀释至200,000个细胞/mL（含细胞的溶液250 μL中含50,000个细胞）。
   17. 将第1.2节中包被的Transwell滤膜放入含有DP的孔中。
   18. 将含细胞的溶液稀释至细胞浓度为 200,000 个/mL。取 250 μL 加入 transwell 小室滤膜上，于 37 °C 培养过夜（图1F).
   19. 第二天，更换培养基，加入1 mL含1 μM尿苷和15 μM 5'-氟-2-脱氧尿苷的共培养基，以抑制间充质细胞过度增殖，防止其阻碍神经突生长。可选：如需进一步干预，可在该培养基中添加生长因子或抑制剂。

表1：共培养培养基。

组分	体积	浓度
MEM α	440 mL
热灭活胎牛血清	50 mL	10%
100x L-谷氨酰胺	5 mL	1x
青霉素-链霉素 100x	5 mL	1x
第2天更换培养基，并加入以下终浓度的有丝分裂抑制剂
尿苷		1 μM
5'-氟-2'-脱氧尿苷		15 μM

结果

图1：获取用于共培养细胞的小鼠解剖示意图。（A）显示打开小鼠颅骨并定位三叉神经节（TG）神经的切割位置示意图，最后一幅图中黑色部分为TG神经。剪刀图标指示剪刀尖端插入位置，沿虚线剪开。（B）明场与GFP荧光图像叠加图，显示被白色圆圈标出的Thy1-YFP+ TG神经。（C）解剖获得的TG神经节可进一步分散并进行培养，如图F所示。（D）P7小鼠的下颌骨，左侧用镊子夹持下颌骨，舌两侧为包含未萌出牙齿的牙槽骨嵴。（E）从矿化结构中提取的牙髓（DP）组织（以圆圈...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟-2'-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503	在共培养体系中用作有丝分裂抑制剂，浓度为 15 μM，第 2 天使用
24 孔细胞培养板	Corning	3524	共培养用培养板
B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J	The Jackson Laboratory	12603	优化方案中用于牙髓细胞的 Tgfbr2f/f 小鼠模型
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	The Jackson Laboratory	3709	用于三叉神经元的 Thy1-YFP 小鼠模型基因型
II 型胶原酶	Millipore	234155-100MG	用于分散三叉神经元
胎牛血清	Gibco	10437	共培养体系中的添加成分
精细镊子	Fine Science Tools	11413-11	用于三叉神经节解剖的精细镊子
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	包被 Transwell 小室，终浓度为 10 μg/mL；储备液浓度设为 1.5 mg/mL
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081	共培养体系中的添加成分
显微解剖剪刀	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	用于打开颅骨的解剖剪刀
最低必需培养基 α	Gibco	12571063	共培养体系的基础培养基
青霉素-链霉素	Gibco	15070063	共培养体系中的抗生素添加成分
磷酸酶抑制剂	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	用于 RIPA 缓冲液中，以提取共培养后牙髓细胞中的蛋白
ThinCert 细胞培养小室	Greiner Bio-One	662631	共培养实验中用于三叉神经元的 Transwell 小室
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	用于分散牙髓细胞
II 型胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T-7409	用于分散三叉神经元
超精细镊子	Fine Science Tools	11370-40	用于解剖操作的超精细镊子
尿苷	Sigma-Aldrich	U3750	在共培养体系中用作有丝分裂抑制剂，浓度为 1 μM，第 2 天使用
安瓿镊	Fine Science Tools	110006-15	用于将组织转移至离心管的长镊子