建立中间神经元与室管膜周围内皮细胞的共培养体系

摘要

来源：Datta, D.，等。人干细胞来源的内皮细胞与GABA能神经元的迁移、化学趋化及共培养实验。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种建立中间神经元与血管周围内皮细胞共培养的技术。将细胞接种至置于培养皿内的单孔插件中。待细胞贴壁后，移除插件，使细胞得以增殖、相互作用并形成共培养体系。

方案

1. 人脑室周围内皮细胞的培养与保存

1. 将人脑室周围内皮细胞培养于基底膜基质包被的（见材料表）6孔板中，使用脑室周围内皮细胞培养基（E6培养基，含50 ng/mL血管内皮生长因子A [VEGF-A]、100 ng/mL成纤维细胞生长因子2 [FGF2] 和5 µM γ-氨基丁酸 [GABA]），置于37 °C、5% CO₂条件下培养。每隔一天更换一次培养基。
2. 在4 °C条件下解冻基底膜基质，用冷的杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）将其稀释成1:100的溶液。每孔加入1 mL基质溶液对6孔板各孔进行包被。使用前将培养板在37 °C孵育至少1小时。
3. 待人脑室周围内皮细胞生长至80%–90%融合度时，吸除孔内培养基。每孔加入1 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
4. 每孔加入1 mL细胞解离液（见材料表）使细胞脱离。在37 °C孵育5分钟。5分钟后，每孔加入1 mL脑室周围内皮细胞培养基。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
   注意：此处使用Accutase进行细胞解离，而第3和第4部分则使用TrypLE。
5. 在室温下以500 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL脑室周围内皮细胞培养基中。
6. 采用台盼蓝排斥法计数活细胞。以1.2 × 10⁵ 个细胞/cm²的密度将细胞接种至新鲜基质包被的培养板中。置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
7. 通过冷冻保存法储存人脑室周围内皮细胞，冷冻液组成为90%脑室周围内皮细胞培养基和10%二甲基亚砜 [DMSO]。
   1. 按照上述步骤1.3和1.4进行细胞解离与收集。采用台盼蓝排斥法对悬液中的细胞进行计数。
   2. 在室温下以500 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于冷冻液中，终浓度为5 × 10⁶ 个细胞/mL。
   3. 每支冻存管中分装1 mL含细胞的冷冻液。将冻存管放入装有异丙醇的冻存盒中，于-80 °C以1 °C/min速率缓慢降温过夜。次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

2. 检测用人脑室周围内皮细胞的制备

1. 使人脑室周围内皮细胞生长至70%–80%融合度。
2. 按照上述步骤1.3至1.5进行细胞解离。使用台盼蓝排斥法计数细胞。

3. 检测用人源GABA能中间神经元的制备

注意： 人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的 GABA 能中间神经元及神经元培养基均购自商业途径（参见材料表）。这些神经元系通过按照生产商开发的方案，将人成纤维细胞来源的 iPSC 系进行分化而获得。细胞解冻与培养均依照生产商提供的方案进行。

1. 解冻人源GABA能中间神经元，并在12孔板中培养两周，使其融合度达到70%–80%。
2. 在检测当天，使用前将细胞解离溶液（见材料表）和一份神经元培养基在37 °C下预热10分钟。
3. 吸除含细胞各孔中的培养基，每孔用1 mL无菌1×PBS洗涤细胞一次。
4. 每孔加入0.5 mL预热的解离溶液，37 °C孵育5分钟以使细胞脱离；每孔加入1 mL神经元培养基，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，轻轻吹打以充分解离细胞团块。
5. 室温下以380 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL神经元培养基中，采用台盼蓝排斥法计数活细胞。

4. 检测用对照人内皮细胞的制备

注意： 对照人iPSC来源的内皮细胞及内皮细胞培养基均购自商业来源（材料表）。这些内皮细胞系通过将人成纤维细胞来源的iPSC细胞系按照试剂供应商提供的方案诱导分化为内皮细胞而获得。细胞按供应商方案解冻后，在纤连蛋白（Fibronectin）包被的基质上进行培养。纤连蛋白包被的培养板按供应商方案预先制备。

1. 解冻对照人血管内皮细胞，并在6孔板中培养至融合度达到80%–90%。
2. 在实验当天，将细胞解离溶液（见材料表）和一份内皮细胞培养基在使用前于37 °C预热10分钟。
3. 吸除含细胞各孔中的培养基。每孔用1 mL无菌1×PBS洗涤细胞。
4. 每孔加入0.5 mL预热的解离溶液使细胞脱离。室温孵育5分钟。每孔加入1 mL内皮细胞培养基以中和解离溶液。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
5. 在室温下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL内皮细胞培养基中。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。

5. 单孔培养插件的制备

1. 在室温下或4 °C过夜解冻1 mg/mL层粘连蛋白溶液。
2. 用0.01%多聚-L-鸟氨酸溶液（每皿1 mL）包被适量的35 mm培养皿。在室温下孵育至少1小时。
3. 使用前立即用无菌水将1 mg/mL层粘连蛋白溶液按1:300稀释，终浓度为3.3 µg/mL。
4. 彻底吸除各培养皿中的多聚-L-鸟氨酸溶液。用无菌水充分冲洗每皿3次，并彻底吸净，以避免多聚-L-鸟氨酸引起的细胞毒性。
5. 向每皿中加入1 mL 3.3 µg/mL层粘连蛋白溶液，在37 °C孵育过夜或至少1小时。使用前立即从培养皿中移除层粘连蛋白溶液。
   注意：也可将含层粘连蛋白的培养皿储存于4 °C。使用前在37 °C细胞培养孵箱中平衡。
6. 使用无菌刀片切割双孔硅胶培养插件（图1A）其中一个孔的三边，制备单孔插件（图1B）。
   注意：切割时保持双孔插件牢固附着于原始包装表面，以确保切口平整并保护插件的粘附性。
7. 吸除培养皿中的层粘连蛋白溶液。
   注意：层粘连蛋白孵育后，切勿用无菌PBS或水洗涤培养皿。湿润表面会阻碍培养插件的紧密粘附。
8. 用无菌镊子取出单孔插件，将其置于经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿中央。沿插件边缘按压，使其牢固固定于培养皿表面。
9. 小心将培养皿倒置，确认插件已牢固粘附。
10. 保持培养皿倒置状态，使用超细尖永久性黑色记号笔标记插件腔室的边界（图1C）。

6. 共培养迁移实验

1. 将 3 × 10⁴ 个 GABA 能中间神经元和 3 × 10⁴ 个人脑室周围内皮细胞共同悬浮于 70 µL 共培养基中（50% 脑室周围维持培养基不含 GABA，50% 神经元培养基）。将该细胞悬液接种至单孔插件腔室内。准备适当数量的此类检测培养皿。
   注意：共培养基中未添加 GABA，以排除外源性 GABA 对细胞迁移的影响。
2. 在显微镜下检查，确认细胞未从插件腔室泄漏。
3. 沿培养皿侧壁缓慢加入 1 mL 共培养基，防止包被层干燥。
   注意：应沿培养皿边缘缓慢加液，避免扰动插件。
4. 作为第一种对照，在每孔插件中仅接种 3 × 10⁴ 个人源 GABA 能中间神经元于 70 µL 共培养基中。准备适当数量的此类培养皿。
5. 作为第二种对照，在每孔插件中将 3 × 10⁴ 个人源 GABA 能中间神经元与 3 × 10⁴ 个人源对照内皮细胞共同接种于 70 µL 共培养基中。准备适当数量的此类培养皿。
6. 将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。孵育 24 小时后，在显微镜下检查，确认细胞已正常贴壁且无泄漏现象。
7. 接种 48 小时后，用无菌镊子轻轻移除插件。在显微镜下检查，确认细胞层未受扰动（第 0 天）。
8. 移除培养基，并加入 1 mL 新鲜共培养基。
   注意：保留适当数量的培养皿用于获取第 0 天的图像。
9. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育 5 天。

结果

图1：培养插件的制备。（A）双孔培养插件。（B）固定在35 mm培养皿中央的单孔插件。（C）移除插件后观察到的矩形区域轮廓。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase 解离液	Millipore Sigma	SCR005	细胞解离溶液（用于脑室周围内皮细胞，步骤 1.4）
对照人源内皮细胞	Cellular Dynamics	R1022
对照内皮细胞培养基添加剂	Cellular Dynamics	M1019
冻存管	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 培养基	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 培养基	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
纤连蛋白	Thermofisher Scientific	33016-015
程序降温冻存盒	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629
人源 GABA 能神经元	Cellular Dynamics	R1013
人源 GABA 能神经元基础培养基	Cellular Dynamics	M1010
人源 GABA 能神经元神经补充剂	Cellular Dynamics	M1032
层粘连蛋白	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	基底膜基质
封片剂	Vector Laboratories	H-1200
多聚-L-鸟氨酸	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
台盼蓝	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	细胞解离溶液（用于 GABA 能中间神经元和内皮细胞，第 3 和第 4 部分）
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF 完全培养基试剂盒	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	对照人源内皮细胞培养基的组分
2 孔硅胶细胞培养插件	ibidi	80209
3 孔硅胶细胞培养插件	ibidi	80369
35 mm 培养皿	Corning	430165
15 ml 锥形离心管	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA 溶液	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6 孔组织培养板	Fisher Scientific	14-832-11