在器官型脑片共培养模型中建立脑肿瘤

本文内容

摘要

本视频展示了三维共培养系统的建立过程。将小鼠脑切片置于膜上，接种荧光标记的人脑肿瘤细胞并使其在其上生长。待系统准备就绪后，对其进行染色以进行成像。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 将切片接种到插入式培养小室上

向6孔板的每个孔中加入1,200 µl的脑片培养基。将未使用的孔加入1,200 µl PBS，并在板的中央区域加入5 ml 1× PBS。将该板置于37 °C环境中保存。
使用带槽的勺子工具，将脑片放入插入物的培养基中，轻轻推动使其完全浸没。对所有脑片重复此操作。
使用1000 µl移液器从插入物顶部吸取1 ml脑片培养基，并将其加入孔底部。吸除并弃去多余培养基，直至脑片周围琼脂糖的边缘可见。对剩余脑片重复此步骤。
用镊子夹住插入物边缘，倾斜以去除多余培养基，然后迅速将插入物转移至含有1 ml脑片培养基的35 mm²培养皿中。使用两对尖头镊子小心去除组织周围的琼脂糖，注意不要拉伸、损伤、切割或戳破膜（最简便的方法是在琼脂糖最边缘处撕开一个小口，然后从两侧将琼脂糖分开）。随后，将插入物移回6孔板中，并对剩余脑片重复此操作。
在关闭吹风装置的组织培养罩内（以防止脑片干燥），清除每张膜上的琼脂糖碎片。
将脑片转移至第1.1步准备好的6孔板中，并将板置于37 °C环境中。孵育脑片24–48小时。

2. 更换脑片培养培养基

3. 在切片上接种肿瘤细胞

将Cm-DiI染料进行超声处理，并以中等速度离心2分钟。
将用于覆盖的肿瘤细胞在201 × g条件下离心5分钟，随后重悬于2 ml切片培养基中。
向2 ml细胞悬液中加入7 µl Cm-DiI，于37 °C孵育20分钟。
在201 × g下离心细胞5分钟，弃上清后重悬于200 µl切片培养基中。轻柔吹打以解离细胞（吹打10–20次，直至沉淀消失），然后加入800 µl切片培养基，使总体积达到1,000 µl。
使用台盼蓝计数活肿瘤细胞。将绿色荧光微球以与细胞相同浓度加入肿瘤细胞悬液中，这些惰性微球将作为对照。将细胞/微球混合液在201 × g下离心5分钟，重悬于适量切片培养基中。以每切片6,000个细胞、体积65 µl的密度接种细胞。根据实验需求和细胞可用性，可适当增加每切片接种的细胞数量。
在组织培养超净台中，将65 µl含细胞的培养基滴加至切片中央。

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材料

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