利用多电极阵列研究脊髓切片间功能性连接的再生

摘要

来源：Heidemann, M.，等。利用多电极阵列培养的脊髓组织型共培养物研究功能再生。J. Vis. Exp. (2015)。

该视频展示了利用基于多电极阵列（MEA）的检测方法实现脊髓内固有神经连接的功能性再生。将脊髓切片放置于MEA上并使其融合。通过制造损伤将融合的切片机械分离，诱导脊髓固有神经元跨越损伤区域生长并重新连接切片。通过评估切片的电活动来确定功能性连接是否成功再生。

方案

1. 微电极阵列（MEA）的制备

注意：微电极阵列（MEA）由玻璃基底、微加工金属电极和SU-8聚合物绝缘层组成。本研究中使用的MEA为商业产品，其电极阵列布局为定制设计（图1 A&B）。68个电极呈矩形网格排列，中间由一条宽300 µm、无电极、无导线和绝缘层的沟槽分为两个区域。每个电极尺寸为40 × 40 µm，电极中心间距为200 µm。记录区域周围设有四个较大的接地电极。此类MEA与其它商用标准MEA的不同之处在于其尺寸（21 mm × 21 mm），且无固定的记录腔室。

1. 消毒时，将微电极阵列（MEA）依次浸入100%乙醇（2次）、70%乙醇（1次）和蒸馏水（2次），每次至少30秒。晾干后，将10至12个MEA放入一个洁净的玻璃培养皿（150 mm × 25 mm）中，并盖上皿盖。
2. 在120 °C条件下对MEA进行高压灭菌20分钟，随后于室温（RT）保存。
3. 配制MEA的包被溶液（见材料清单），分装后储存于-20 °C。
4. 将每个MEA单独放入无菌培养皿（35 mm × 10 mm）中。
5. 使用预冷的移液器将150 µl冷藏的包被溶液滴加至电极表面，盖上培养皿盖。约10分钟后，检查电极表面是否有气泡，必要时用包有橡胶的刮刀轻轻去除。室温（RT）静置1小时。
6. 吸除残留的包被溶液，先用适用于产前及胚胎神经元的优化培养基清洗1次，再用无菌蒸馏水清洗2次。若MEA次日才使用，则在培养箱中37 °C条件下用无菌蒸馏水浸泡过夜（O/N）；否则，直接在室温下晾干。

2. 器官型培养物制备与培养所需试剂

1. 准备无钙清洗液（参见材料列表）。
2. 用清洗液重悬鸡血浆（1:1，轻轻振荡，避免产生气泡），在 3,000 × g 下离心约 20 分钟，将上清液倒入无菌管中。分装 200 µl 至冻存管，于 -20 °C 保存。
3. 按相应方法重悬牛血浆凝血酶（200 U/ml），并经无菌滤器（0.2 µm 孔径）过滤。分装 200 µl 至冻存管，于 -20 °C 保存。
4. 为 30 个培养物准备 100 ml 营养培养基（参见材料列表）。

3. 脊髓组织解剖

注意：根据胚胎数量的不同，该操作可制备出约 25 - 35 个共培养所需的脊髓切片，所有步骤均需在超净工作台内无菌条件下进行。

1. 通过肌肉注射向母体动物施用致死剂量的戊巴比妥钠（0.4 ml）。通过检测足部回缩反射确认深度麻醉。通过剖腹产取出胚胎第14天（E14）的大鼠胚胎，并通过断头法处死。
2. 将胚胎尸体转移至盛有无菌、预冷的清洗液的培养皿中。
3. 使用解剖刀在后肢上方和前肢上方各进行一次完整的横向切割，移除四肢。接着，在额状面进行切割，将内脏与包含脊髓的背部组织分离。
4. 进行切片时，将含有脊髓的背部组织逐个转移至固定盘上，使用组织切片机切割成厚度为225–250 µm的切片。在切好的组织上滴加一滴清洗液，并用刮铲将切片转移至盛有无菌、预冷清洗液的35 mm × 10 mm培养皿中。
5. 对每一片切片单独操作，将脊髓从周围残留组织中解剖分离，保留与之相连的背根神经节。
6. 让切片在4 °C下静置1小时。

4. 在多电极阵列上固定脊髓组织切片

1. 在培养箱中预热无菌营养培养基（37 °C，瓶盖轻轻拧松以供氧）。
2. 使用带有橡胶尖端的无菌镊子，在体视显微镜下将MEA置于培养皿中，室温操作，确保电极阵列处于焦点位置。在洁净、无尘且无菌的电极阵列中央滴加6 µl鸡血浆。用小型刮铲小心地将两段脊髓组织腹侧相对地滑入血浆液滴中。操作时避免刮铲接触电极。
3. 在鸡血浆液滴周围加入 8 µl 凝血酶。使用凝血酶移液枪头，小心混合并均匀铺开鸡血浆与凝血酶的混合物，覆盖两片组织切片。注意切勿直接触碰脆弱的电极阵列。在凝血发生前，吸除多余的鸡血浆与凝血酶混合物。
4. 将培养皿盖好以保持高湿度，将MEA/培养物组装体置于37 °C培养箱内的湿化 chamber 中静置约1小时。
5. 向培养室中小心加入10 µl营养培养基，盖上培养皿盖，放回培养箱中孵育约30分钟。
6. 将每个MEA/培养组件用无菌橡胶包被的尖端放入滚瓶中，加入3 ml营养培养基并 tightly 关闭瓶盖。将滚瓶置于培养箱内的滚筒中，以1 - 2 rpm转速旋转。₂含37 °C的培养环境
7. 7天后更换一半的培养基 体外 （体外培养天数）以及之后每周1-2次。

5. 机械性损伤

1. 用无菌的橡胶包头镊子将MEA/培养组件从滚筒管中取出，放入无营养液的培养皿中，在体视显微镜下对准组织位置。通过肉眼确认两个组织切片已融合。
2. 用橡胶包头镊子轻压MEA，固定MEA/培养组件，保持其稳定。
3. 将手术刀片置于MEA的凹槽内，靠近组织切片处，刀片保持较水平的方向。
4. 轻轻抬起刀柄，同时使刀片仍停留在MEA的凹槽中，使刀片从刀根向刀尖方向“滚动”，从而切断覆盖在凹槽上的组织。
5. 如有必要，使用25 G针头切断任何残留的组织连接。操作仅限于凹槽区域内，避免触碰脆弱的边缘。
6. 将MEA/培养组件放回滚筒管中，向培养物中加入3 ml新鲜营养液，并将其放回培养箱内的滚筒中继续培养。

6. 自发活动的电生理记录

1. 为研究选定 DIV 天数后两个脊髓切片之间的功能再生情况，将 MEA/培养组件安装在显微镜下的记录室中，并加入约 500 µl 细胞外溶液（见材料列表）。
2. 首次记录前等待 10 分钟，使系统达到稳定状态。
3. 在室温下，从 MEA 的每个活性检测电极分别记录约 10 分钟的基础自发活动，重复 2 次。
4. 为确保细胞外环境稳定，每次记录结束后更换细胞外溶液。

结果

图1. 自发性活动的显示与分析。（A）MEA 示意图。铂覆盖的电极以黑色表示，透明导线为红色，MEA 中央的沟槽为黄色。（B）位于 MEA 中心的电极阵列的放大图。示意图由 M. Heuschkel 博士惠赠提供。（C）培养 8 天（DIV）的明场图像。组织切片已沿相对的侧面生长并融合。黄色条带代表 MEA 上无电极和绝缘层的沟槽。比例尺 = 400 µm。（D）实验时间线。将 E14 大鼠胚胎的两个脊髓切片并排置于 MEA 上。数天内，切片沿相对侧面生长并融合。在培养 8 至 28 天（DIV）期间，通过融...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平面多电极阵列	Qwane Biosciences		根据本实验室设计定制
营养培养基			配制 100 ml
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	31966-021	80 ml
马血清	Gibco	26050-070	10 ml
蒸馏灭菌水			10 ml
神经生长因子-7S [5ng/mL]	Sigma-Aldrich	N0513	200 µl
			用含1% BSA的洗涤液重悬
包被液
细胞外基质凝胶	BD Biosciences	356230	必须始终保持低温；用专用于产前及胚胎神经元的优化培养基按1:50稀释
专用于产前及胚胎神经元的优化培养基	Gibco	21103-049
洗涤液			[mg/L]
MgCl2-6H2O			100
MgSO4-7H2O			100
KCl			400
KH2PO4			60
NaCl			8000
Na2HPO4 无水			48
D-葡萄糖（右旋糖）			1000
			根据 http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html 上的方案配制
细胞外溶液（pH 7.4）			[mM]
NaCl			145
KCl			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES			5
丙酮酸钠			2
葡萄糖			5
鸡血浆	Sigma-Aldrich	P2366	冻干粉，用洗涤液重悬
微量移液管	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
凝血酶	Merck Millipore	1123740001	刺激性，致敏性，用洗涤液重悬
组织培养平管 10（即滚管）	Techno Plastic Products AG	91243