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方法文章

使用一次性生物反应器从诱导多能干细胞生成成熟小脑类器官

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Silva, T.P.，等。由人多能干细胞可扩展地生成成熟的小脑类器官及其通过免疫染色的表征。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种利用一次性三维生物反应器从诱导多能干细胞（iPSCs）生成成熟小脑类器官的技术。该生物反应器可促进iPSC聚集体的形成，随后通过一系列富含生长因子和趋化因子的培养基处理，诱导iPSC聚集体分化为成熟的小脑类器官。之后，收集类器官并进行冷冻保存，以供后续分析。

方案

1. 在生物反应器中接种人诱导多能干细胞

  1. 将单层培养的iPSCs在mTeSR1培养基中孵育，培养基中添加10 µM的ROCK抑制剂Y-27632（ROCKi）。每孔加入1 mL补充后的培养基至6孔组织培养板中，在37 °C、95%湿度和5% CO2条件下孵育1小时。
    注意：ROCKi用于保护解离的iPSCs免于发生凋亡。
  2. 孵育1小时后，吸除各孔中的废弃培养基，并用1 mL 1× PBS每孔洗涤一次。
  3. 向6孔板的每孔中加入1 mL细胞解离培养基（见材料表），在37 °C孵育7分钟，直至细胞在轻微振荡下易于从孔壁脱落。
  4. 使用P1000移液器反复吹打细胞解离培养基，使细胞脱落并解离为单细胞。每孔加入2 mL完全细胞培养基以终止酶消化作用，并轻柔吹打细胞悬液，转移至无菌锥形管中。
  5. 以210 × g离心3分钟，弃去上清液。
  6. 将细胞沉淀重悬于培养基（即含10 µM ROCKi的mTeSR1）中，使用台盼蓝染色法和血细胞计数板对iPSCs进行计数。
  7. 在生物反应器中接种15 × 106个单细胞（最大体积为100 mL），加入60 mL含10 µM ROCKi的mTeSR1，最终细胞密度为250,000个细胞/mL。
  8. 将含有iPSCs的容器置于恒温箱内的通用底座单元中，设置温度为37 °C、湿度95%、CO2浓度5%。
    注意：通过将通用底座单元的转速设定为27 rpm，持续搅拌24小时，以促进iPSC形成细胞团聚体。

2. 小脑类器官中人iPSC来源的细胞团的分化与成熟

  1. 将单细胞接种的当天定义为第0天。
  2. 在第1天，使用血清移液管收集1 mL的iPSC细胞团样本。在取样前，将装有细胞团的生物反应器置于通用底座单元中，并放入无菌操作台内，继续维持与之前相同的振荡条件。将细胞悬液接种至超低吸附24孔板中。检查是否已形成由iPSC衍生的细胞团。
  3. 使用光学显微镜以40倍或100倍的总放大倍数拍摄图像，用于测量细胞团直径。
  4. 使用FIJI软件测量每张图像中细胞团的面积。
    1. 从菜单栏选择“分析 | 设定测量”（Analyze | Set Measurements），勾选“面积”（Area），点击“确定”（OK）。
    2. 从菜单栏选择“文件 | 打开”（File | Open）以打开存储的图像文件。选择工具栏中的直线选择工具，在图像中的标尺上画一条直线。然后从菜单栏选择“分析 | 设定标尺”（Analyze | Set scale）。
    3. 在“已知距离”（Known distance）中输入图像标尺的长度（单位为 µm），将“长度单位”（Unit of length）定义为 µm。点击“全局”（Global）以保存设置，然后点击“确定”（OK）。在工具栏中选择椭圆选区工具（Oval Selection）。
    4. 对每个细胞团，使用椭圆工具勾勒其面积区域，然后选择“分析 | 测量”（Analyze | Measure）。根据测得的面积计算其直径，假设细胞团近似为球形，使用以下公式：
      直径计算公式；直径等于4A除以π的平方根；数学公式。
      其中A为细胞团的面积。
  5. 当细胞团的平均直径达到100 µm时，更换80%的旧培养基为新鲜的mTeSR1培养基（不含ROCKi）。当细胞团直径达到200–250 μm时，将全部旧培养基更换为gfCDM培养基 (表1)，并让类器官沉降至生物反应器底部。
    注意： 若细胞团平均直径超过350 μm，则不应启动分化程序，需重新进行单细胞接种。通常情况下，细胞团约需1天时间达到平均100 µm的直径。
  6. 将含有细胞团的生物反应器放入置于培养箱内的通用底座单元中，培养条件为37 °C、95%湿度和5% CO2。
  7. 将生物反应器的振荡速度降低至25 rpm。
  8. 在第2天，重复步骤2.2、2.3和2.4以评估细胞团直径。向60 mL gfCDM分化培养基中加入30 μL FGF2（终浓度为50 ng/mL）和60 μL SB431542（终浓度为10 μM）(表1)。将生物反应器中的全部旧培养基更换为添加了上述因子的gfCDM培养基。重复步骤2.6。
    注意：SB431542对抑制中胚层和内胚层分化、诱导神经分化至关重要。FGF2用于促进神经上皮组织的尾部化。
  9. 在第5天，重复步骤2.2、2.3、2.4和2.8。
    注意： 在分化过程中，细胞团的尺寸应逐渐增大。然而，仅在分化起始时直径参数较为关键，因其可能影响分化的效率。
  10. 在第7天，重复步骤2.2、2.3和2.4。将FGF2和SB431542的添加量稀释至原来的2/3：向60 mL gfCDM分化培养基中加入20 μL FGF2和40 μL SB431542。将生物反应器中的全部旧培养基更换为添加了上述因子的gfCDM培养基。重复步骤2.6，并将生物反应器的振荡速度提高至30 rpm。
  11. 在第14天，重复步骤2.2、2.3和2.4。向60 mL gfCDM分化培养基中加入60 μL FGF19（终浓度为100 ng/mL）。将生物反应器中的全部旧培养基更换为添加了FGF19的gfCDM培养基。重复步骤2.6。
    注意： FGF19用于促进中后脑结构的极化。
  12. 在第18天，重复步骤2.2、2.3、2.4和2.11。
  13. 在第21天，重复步骤2.2、2.3和2.4。将生物反应器中的全部旧培养基更换为完全神经基础培养基 (表1)。重复步骤2.6。
    注意： 神经基础培养基是一种基础培养基，用于维持类器官内的神经元细胞群体。
  14. 在第28天，重复步骤2.2、2.3和2.4。向60 mL完全神经基础培养基中加入180 μL SDF1（终浓度为300 ng/mL）。将生物反应器中的全部旧培养基更换为添加了SDF1的完全神经基础培养基。重复步骤2.6。
    注意： SDF1用于促进不同细胞层的有序组织形成。
  15. 在第35天，重复步骤2.2、2.3和2.4。将生物反应器中的全部旧培养基更换为完全BrainPhys培养基 (表1)。重复步骤2.6。
    注意： BrainPhys是一种支持突触活性神经元的神经元培养基。
  16. 从第35天起，每隔3天更换总培养基体积的1/3，使用完全BrainPhys培养基，直至分化第90天。

表1：储备液和培养基的配制。 列出了用于iPSCs维持和分化方案的培养基所需的所有组分和体积，以及生长因子和小分子的储备液。对于储备液，列出了所有储备浓度及重悬方案。

培养基制备mTeSR1
终体积：500 mL		1. 在室温（RT）或4 °C过夜解冻mTeSR1 5×添加剂，并与基础培养基混合
2. 完全配制的mTeSR1培养基可于4 °C保存最多2周，或分装为40 mL等份后于-20 °C保存
3. 使用前在室温预温完全配制的mTeSR1培养基
gfCDM（无生长因子化学成分明确培养基）
终体积：60 mL		30 mL Ham's F12，30 mL IMDM，600 µL 化学成分明确脂质浓缩液（1 % v/v），2.4 µL 单硫代甘油（450 μM），30 µL 载脂蛋白-转铁蛋白（水溶液储存液，30 mg/mL，终浓度：15 μg/mL），300 mg 结晶纯化BSA（5 mg/mL），42 µL 胰岛素（储存液浓度10 mg/mL，终浓度：7 µg/mL），300 µL P/S（0.5% v/v，50 U/mL青霉素/50 μg/mL链霉素）
Neurobasal
终体积：60 mL		60 mL Neurobasal培养基，600 µL N2添加剂，600 µL Glutamax I，300 µL P/S（0.5 % v/v）
完全配制的BrainPhys
终体积：60 mL		60 mL BrainPhys，1.2 mL NeuroCult SM1神经元添加剂，600 µL N2添加剂，12 µL BDNF（终浓度：20 ng/mL），12 µL GDNF（终浓度：20 ng/mL），300 µL 二丁酰-cAMP（储存液浓度：100 mg/mL，终浓度：1 mM），42 µL 抗坏血酸（储存液浓度：50 µg/mL，终浓度：200 nM）
生长因子与小分子化合物的储存液碱性成纤维细胞生长因子（bFGF/FGF2）
储存液浓度：100 µg/mL		1. 用5 mM Tris（pH 7.6）溶解至10 mg/mL浓度
2. 用含0.1 % BSA的PBS（v/v）稀释至终储存液浓度100 µg/mL
基质细胞衍生因子1（SDF1）
储存液浓度：100 µg/mL		1. 用水溶解至10 mg/mL浓度
2. 用含0.1 % BSA的PBS（v/v）稀释至终储存液浓度100 µg/mL
脑源性神经营养因子（BDNF）
储存液浓度：100 µg/mL<
胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）
储存液浓度：100 µg/mL
成纤维细胞生长因子19（FGF19）
储存液浓度：100 µg/mL		1. 用5 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）溶解至10 mg/mL浓度
2. 用含0.1 % BSA的PBS（v/v）稀释至终储存液浓度100 µg/mL
ROCK抑制剂Y-27632
储存液浓度：10 mM		用DMSO溶解至10 mM浓度
SB431542
储存液浓度：10 mM
胰岛素
储存液浓度：10 mg/mL		1. 将10 mg胰岛素溶于300 µL 10 mM NaOH中
2. 小心滴加1 M NaOH直至溶液变得澄清透明
3. 用无菌水定容至1 mL

表2：用于制备类器官以进行冷冻切片和免疫染色的溶液。 列出了用于制备类器官进行冷冻切片和免疫染色过程中所用溶液的全部组分及其体积。

明胶/蔗糖
终浓度：7.5%/15% w/w		1. 在无菌肖特玻璃瓶中称取15 g蔗糖和7.5 g明胶，并充分混匀
2. 将1× PBS预热至65 °C
3. 加入预热的1× PBS，使总重量达到100 g，并充分混匀
4. 将肖特玻璃瓶置于65 °C加热板上，振荡至明胶完全溶解
5. 在37 °C孵育，直至溶液稳定

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BrainPhys 神经元培养基 N2-A & SM1 试剂盒5793 - 500mLStem cell technologies
化学成分明确的脂质浓缩液11905031ThermoFisher
结晶纯化牛血清白蛋白（BSA）5470Sigma
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
胎牛血清A3840001ThermoFisher
牛皮明胶G9391Sigma
Glutamax I10566-016ThermoFisher
二丁酰环磷酸腺苷（Dibutyryl cAMP）SC- 201567B -500mg Frilabo
Ham's F1221765029ThermoFisher
人游离型 iPSC 细胞系A18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
胰岛素91077CSigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
异戊烷PHR1661-2MLSigma
L-抗坏血酸A-92902Sigma
Matrigel354230Corning基底膜基质
巯基甘油M6154Sigma
mTeSR185850 -500mlStem cell technologies
N2 添加剂17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
多聚甲醛158127Sigma
PBS-0.1 一次性使用容器SKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive 基础单元SKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
重组人脑源性神经营养因子（BDNF）450-02Peprotech
重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF/FGF2）100-18BPeprotech
重组人成纤维细胞生长因子19（FGF19）100-32Peprotech
重组人胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）450-10Peprotech
重组人基质细胞衍生因子1（SDF1）300-28APeprotech
ROCK 抑制剂Y-27632 72302Stem cell technologies
SB431542S4317Sigma
蔗糖S7903Sigma
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂25608-930VWR

标签

一次性生物反应器神经分化生长因子处理聚集体形成小脑前体细胞免疫染色分析流式细胞术共聚焦显微镜
使用一次性生物反应器从诱导多能干细胞生成成熟小脑类器官
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