从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性免疫细胞

摘要

来源：Baker, G. J., 等., Lowenstein, P. R. 胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了利用机械解离和酶消化法从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性外周血单个核细胞的过程。随后通过密度梯度离心收集免疫细胞，以用于后续分析。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

在无菌塑料容器中，将90 ml的10倍浓度PBS加入264 ml超纯去离子水（3.93倍稀释）中，配制密度梯度离心介质混合液。用HCl调节pH至7.0–7.2，经0.22 µm滤膜过滤除菌。4 °C保存。

在50 ml聚丙烯离心管中，将18 ml密度梯度离心介质混合液与30 ml密度梯度离心介质混合，配制70%密度的离心介质（具体试剂详见材料列表）。4 °C保存，使用前恢复至室温。

在50 ml离心管中，将9.6 ml DPBS与10.4 ml 70%密度的离心介质混合，配制37%密度的离心介质。4 °C保存，使用前恢复至室温。

1. 胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离

1. 使用洁净的单刃剃须刀片，通过在脑正中做矢状切口将两个半球分开，从而分离出包含肿瘤的脑区。将同侧半球内侧面朝下放置，分别在小脑和嗅球水平做两个冠状切口，以分离出含有肿瘤植入物的目标组织 （图1A）。对侧半球的等效部分也可被分离并用作阴性对照。
2. 将目标组织放入相应标记的玻璃Dounce组织研磨器中，加入1 ml DPBS，将研磨杵完全推到底部并旋转7次，初步破碎组织。提起研磨杵，使液体重新沉降至研磨器底部。重复此步骤三次；但在接下来的两次重复中仅旋转4次，最后一次旋转3次，以避免过度吹打组织。
3. 使用P-1000微量移液器，沿研磨杵侧壁依次加入三份1 ml冰冻DPBS，冲洗残留物进入研磨器。
4. 通过反复吹吸重悬已吹打的脑组织，并将其转移至冰上标记好的15 ml离心管中。用额外1 ml冰冻DPBS冲洗Dounce组织研磨器内壁，并将冲洗液加入同一15 ml离心管中。所有含有吹打后脑组织的离心管均需保持在冰上，直至所有样本处理完毕。
5. 所有样本处理完成后，将15 ml离心管中的脑组织悬液在4 °C条件下以740 × g（最大相对离心力）离心20分钟。
6. 用10 ml移液管和移液器吸除上清液，并使用P-1000移液器将沉淀的脑组织重悬于1 ml预先配制的胶原酶/DNase-I消化酶溶液中。将15 ml离心管放入试管架中，置于37 °C水浴中孵育15分钟。
7. 在孵育过程中，轻轻弹击管壁两次，以促进组织解离。
8. 使用10 ml移液管向每管中加入6 ml冰冻DPBS，以稀释消化酶。通过吹吸重悬细胞，然后将全部液体经无菌70 µm尼龙滤网过滤，收集至冰上新标记的15 ml离心管中。
9. 将脑细胞悬液在4 °C条件下以740 × g（最大相对离心力）离心20分钟，获得单细胞沉淀 （图1B）。从离心机取出15 ml离心管后立即置于冰上，并将离心机温度设定调高至约21 °C，为下一步操作做准备。
10. 彻底吸除每管中的上清液，使用P-1000微量移液器将沉淀初步重悬于1 ml 70%密度梯度离心介质中。然后使用10 ml移液管向每管中再加入4 ml 70%密度梯度离心介质。拧紧管盖，通过轻柔倒置数次混匀细胞悬液。
11. 将含有脑细胞并重悬于70%密度梯度离心介质中的15 ml离心管从冰上取出，置于室温下的试管架中。逐个使用P-1000微量移液器，小心地将2 ml 37%密度梯度离心介质溶液叠加到5 ml 70%密度梯度离心介质上方，形成两层密度介质之间的清晰界面 （图1C）。
    1. 使用细头记号笔标记界面位置，以便在离心后界面变得不明显时仍可轻松识别。
12. 将15 ml离心管在室温下以740 × g（最大相对离心力）离心20分钟，离心过程中不设刹车，以避免破坏界面。
13. 离心后，使用P-200微量移液器从管壁侧方插入，小心绕过脂质层，收集聚集在两层密度梯度介质界面处的外周血单个核细胞（PBMCs）（图1D）。
    1. 到达PBMC条带位置后，缓慢从70%密度梯度介质层表面吸取200 µl，转移至冰上相应标记的聚丙烯FACS管中。重复一次，每样本共收集400 µl。
14. 向每支含有400 µl PBMCs的FACS管中加入3 ml流式缓冲液，充分稀释密度梯度介质，然后在4 °C条件下以660 × g（最大相对离心力）离心20分钟。

结果

图1：胶质瘤浸润性PBMC的分离。 (A) 分离含有早期原位胶质瘤移植灶的小鼠脑组织的策略。上方图示为将同侧半球从对侧半球分离的矢状面切开操作。下方图示为为分离包含肿瘤移植灶的目标组织（以紫色高亮显示）所需的另外两个冠状切面。(B) 经酶消化、通过70 μm尼龙滤网过滤并离心后获得的单细胞脑组织沉淀（白色箭头所示）。(C) 离心前正确制备的密度梯度离心介质。白色箭头指示两种密度离心介质层之间形成的清晰界面。(D) 离心后密度梯度离心介质的分层情况，显示在37%密度离心介质层顶部形成的脂质层（白色箭头）以及位于两...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
伊格尔培养基的杜尔贝科改良版	Gibco	12430-054	含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES 和酚红
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144	不含氯化钙或氯化镁
胎牛血清	Omega Scientific Inc.	FB-11
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	10,000 U/ml 青霉素；10,000 μg/ml 链霉素
0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管	Genesee Scientific	22-272
聚氨酯冰桶	Fisherbrand	02-591-45	容量：0.152 oz. (4.5 L)
胶原酶（I-S 型）	Sigma Aldrich	C1639	来源于 Clostridium histolyticum
脱氧核糖核酸酶 I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2,000 Kunitz 单位/毫克干重
大型解剖剪	Ted Pella Inc.	1316
小型解剖剪	FST	14094-11
钝头镊子	Ted Pella Inc.	13250
7 ml 玻璃 Dounce 组织研磨器	Kontes	KT885300-0007
Percoll 密度梯度离心介质	GE Healthcare	GE17-0891-01
10 ml 血清移液管	Genesee Scientific	12-104	一次性使用；无菌
70 μm 无菌尼龙网细胞滤筛	Fisherbrand	22363548
15 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-103	锥底
50 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-108	锥底
12×75 mm 圆底聚丙烯 FACS 管	Fisherbrand	14-956-1B