从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性免疫细胞

摘要

来源：Baker, G. J., 等., Lowenstein, P. R. 胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析。J. Vis. Exp. (2015)

该视频展示了利用机械解离和酶消化法从小鼠脑组织中分离肿瘤浸润性外周血单个核细胞的过程。随后通过密度梯度离心收集免疫细胞，以用于后续分析。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

在无菌塑料容器中，将90 ml的10倍浓度PBS加入264 ml超纯去离子水（3.93倍稀释）中，配制密度梯度离心介质混合液。用HCl调节pH至7.0–7.2，经0.22 µm滤膜过滤除菌。4 °C保存。

在50 ml聚丙烯离心管中，将18 ml密度梯度离心介质混合液与30 ml密度梯度离心介质混合，配制70%密度的离心介质（具体试剂详见材料列表）。4 °C保存，使用前恢复至室温。

在50 ml离心管中，将9.6 ml DPBS与10.4 ml 70%密度的离心介质混合，配制37%密度的离心介质。4 °C保存，使用前恢复至室温。

1. 胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离

1. 使用洁净的单刃剃须刀片，通过在脑正中做矢状切口将两个半球分开，从而分离出包含肿瘤的脑区。将同侧半球内侧面朝下放置，分别在小脑和嗅球水平做两个冠状切口，以分离出含有肿瘤植入物的目标组织 （图1A）。对侧半球的等效部分也可被分离并用作阴性对照。
2. 将目标组织放入相应标记的玻璃Dounce组织研磨器中，加入1 ml DPBS，将研磨杵完全推到底部并旋转7次，初步破碎组织。提起研磨杵，使液体....

结果

图1：胶质瘤浸润性PBMC的分离。 (A) 分离含有早期原位胶质瘤移植灶的小鼠脑组织的策略。上方图示为将同侧半球从对侧半球分离的矢状面切开操作。下方图示为为分离包含肿瘤移植灶的目标组织（以紫色高亮显示）所需的另外两个冠状切面。(B) 经酶消化、通过70 μm尼龙滤网过滤并离心后获得的单细胞脑组织沉淀（白色箭头所示）。(C) 离心前正确制备的密度梯度离心介质。白色箭头指示两种密度离心介质层之间形成的清晰界面。(D) 离心后密度梯度离心介质的分层情况，显示在37%密度离心介质层顶部形成的脂质层（白色箭头）以及位于两.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
伊格尔培养基的杜尔贝科改良版	Gibco	12430-054	含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES 和酚红
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144	不含氯化钙或氯化镁
胎牛血清	Omega Scientific Inc.	FB-11
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	10,000 U/ml 青霉素；10,000 μg/ml 链霉素
0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管	Genesee Scientific	22-272
聚氨酯冰桶	Fisherbrand	02-591-45	容量：0.152 oz. (4.5 L)
胶原酶（I-S 型）	Sigma Aldrich	C1639	来源于 Clostridium histolyticum
脱氧核糖核酸酶 I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2,000 Kunitz 单位/毫克干重
大型解剖剪	Ted Pella Inc.	1316
小型解剖剪	FST	14094-11
钝头镊子	Ted Pella Inc.	13250
7 ml 玻璃 Dounce 组织研磨器	Kontes	KT885300-0007
Percoll 密度梯度离心介质	GE Healthcare	GE17-0891-01
10 ml 血清移液管	Genesee Scientific	12-104	一次性使用；无菌
70 μm 无菌尼龙网细胞滤筛	Fisherbrand	22363548
15 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-103	锥底
50 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-108	锥底
12×75 mm 圆底聚丙烯 FACS 管	Fisherbrand	14-956-1B