选择性去除大鼠小脑颗粒神经元培养物中的小胶质细胞

摘要

来源：Jebelli, J.，等。利用L-亮氨酸甲酯选择性耗竭小脑颗粒细胞培养物中的小胶质细胞。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种从原代大鼠神经元培养物中选择性去除小胶质细胞的技术。小脑颗粒神经元经抗代谢物处理，以清除增殖的胶质细胞；此外，还使用靶向溶酶体的试剂处理，以耗竭培养物中的小胶质细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

1. 准备两把不锈钢实验解剖剪和两把不锈钢实验镊子。将所有器械进行高压灭菌，并置于生物安全柜中，在紫外灯（UV）下过夜照射以进一步灭菌。
2. 配制500 ml最低必需培养基（MEM）培养液（含10% 胎牛血清[FBS]、20 mM KCl、25 mM NaHCO₃、30 mM D-葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和6 μg/ml 氨苄青霉素），经滤膜过滤除菌。4 °C下可保存数月。
3. 准备24孔细胞培养板，每孔放入直径14 mm、厚度为1号的盖玻片。将盖玻片进行高压灭菌，并用100 mg/L多聚-D-赖氨酸（PDL）包被。再置于紫外灯下过夜灭菌。

2. 小脑颗粒细胞（CGC）培养液的制备

1. 在100 ml经高压灭菌和紫外光处理的无菌去离子水（dH₂O）中配制“溶液A”，其中包含250 mg葡萄糖、300 mg牛血清白蛋白（BSA）、955 mg磷酸盐缓冲液（PBS，不含Ca²⁺和Mg⁺），以及1 ml 3.8% MgSO₄·7H₂O。
2. 在9 ml溶液A中加入1 ml浓度为5 mg/ml的胰蛋白酶，配制成“溶液B”（10 ml）。
3. 在溶液A中加入1,000单位DNase、0.5 mg大豆胰蛋白酶抑制剂和100 µl 3.8% MgSO₄·7H₂O，定容至10 ml，配制成“溶液C”（10 ml）。
4. 取3.2 ml溶液C，用溶液A定容至20 ml，配制成“溶液D”（20 ml）。
5. 配制含EBSS、25 mM NaHCO₃、3 mM MgSO₄·7H₂O和4% BSA的BSA/Earle's平衡盐溶液（EBSS），调节pH至7.4。
6. 将纯L-亮氨酸甲酯（LME）加入5 ml MEM培养基中，使终浓度为150 mM LME，使用台式pH计调节溶液pH至7.4，并用28 mm聚醚砜（PES）0.2 µm注射器滤器过滤除菌。

3. 培养CGCs

1. 从4至7日龄的大鼠幼崽中采集小脑，立即放入含有5 ml溶液A并置于冰上的培养皿中。
2. 倒掉小脑组织上多余的溶液，将组织置于培养皿盖中。
3. 用充分灼烧过的剃刀片将组织在至少三个不同方向上切碎。
4. 将切碎的组织加入溶液B中（用溶液冲洗培养皿，以确保尽量减少组织损失），置于37 °C水浴中5 min，每隔几分钟轻轻振荡。
5. 向管中加入溶液D（20 ml）以中和胰蛋白酶，混匀后于65 × g离心5分钟。
6. 倒掉上清液。
7. 用4 ml溶液C重悬，使用三支经火焰处理、直径依次减小的玻璃移液管充分吹打（每支约10次），直至悬浮液尽可能均匀。
8. 缓慢轻柔地将几滴该匀浆液加至BSA/EBSS液面上方。若匀浆开始沉入BSA/EBSS中，则需进一步吹打，和/或加入少量溶液C。匀浆液应分层停留在BSA/EBSS液面之上。切勿振荡。以100 × g离心5分钟。
9. 吸除上清液，将沉淀物（松软）重悬于1 ml MEM培养基中。
10. 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞以每盖玻片800,000个细胞接种于500 µl MEM培养基中。置于37 °C、6% CO₂的培养箱中培养。₂.
11. 第二天（制备后24-36小时）更换培养基。配制含有10 µM细胞周期抑制剂阿糖胞苷（AraC）的MEM培养基溶液。
    1. 对于每个盖玻片，将250 µl旧培养基保留在新的24孔板中，其余部分吸除；加入250 µl正常MEM培养基，吸除以洗涤细胞。然后将上述保留的250 µl旧培养基重新加回细胞中，并补加250 µl含AraC的培养基。
       注意： 细胞可在6天后使用 体外 （体外培养天数）

4. 选择性清除小胶质细胞（在6 DIV时进行）

1. 向5 ml的MEM培养基等分试样中加入纯LME，使LME的终浓度为150 mM。
2. 将溶液调至pH 7.4，并使用28 mm聚醚砜（PES）0.2 µm针头滤器过滤除菌。
3. 将溶液用MEM培养基稀释至50 mM（2 × LME）浓度，并与正常MEM培养基一同置于37 °C水浴中孵育10分钟，用于对照组培养。
4. 从CGC培养物中移除一半（250 µl）MEM培养基，并在37 °C下保留。
5. 用含有2倍LME（250 µl）的MEM培养基处理细胞， 即 按1:1稀释，得到25 mM的孔内浓度，或加入不含LME的预温MEM培养基（250 µl）作为对照培养。
6. 在37 °C、含6% CO₂的湿润环境中孵育细胞₂ 1小时。
7. 用新鲜的预温MEM培养基洗涤细胞两次，以去除含LME的培养基，然后将保留的培养基与等体积的新鲜预温MEM培养基分别替换至相应的孔中。
8. 将培养物放回培养箱（加湿，含6% CO₂）₂ 在37 °C下孵育，并静置24小时后再进行任何后续处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子	Sigma-Aldrich	F4142	弯曲末端有助于取出小脑
显微解剖剪	Sigma-Aldrich	S3146	直头、尖端锋利，便于对P4-7期啮齿类动物进行解剖
L-亮氨酸甲酯盐酸盐	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS溶液	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	27964-99-4	盖玻片使用前1天包被
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9418
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4417
脱氧核糖核酸酶（DNase）	Sigma-Aldrich	D5025
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	T6414