建立大鼠脑源性胶质细胞的三维培养

摘要

来源：Koss，K. M, 等 改良的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症的建模 视频实验杂志 (2017).

本视频展示了一种建立胶质细胞三维培养的技术。将来源于大鼠脑的胶质细胞包埋在含有细胞外基质成分的光交联聚合物基质中。在培养基中孵育后，胶质细胞在支撑基质内增殖，形成三维培养体系。

方案

使用断头法处死出生第1天的Sprague Dawley大鼠幼鼠以提取脑组织的实验方案，已获得阿尔伯塔大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 小胶质细胞和星形胶质细胞的分离

注意： 所有用于分离和细胞培养的培养基均在水浴中预热至 37 °C。Hank's 平衡盐溶液（HBSS）含有 1% 青霉素-链霉素（PS）。所有添加 Ham's F12 营养混合物的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM/F12）均补充有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（PS）。仅含胰蛋白酶的混合液不含 FBS。本实验方案中的所有材料均为无菌（经过滤、酒精处理、购买时无菌或经高压灭菌），自步骤 1.8 之后的所有操作均在生物安全柜中采用无菌技术进行。

1. 每个大脑，预先将 15 mL HBSS 和 12.5 mL DMEM/F12 在 50 mL 锥形离心管中加热至 37 °C，并在 15 mL 锥形离心管中预热约 2 mL 含 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 0.25% 胰蛋白酶。额外加热 25 mL DMEM/F12。使用前约 10 分钟预热胰蛋白酶，以防止酶活性丧失。
2. 将足够量的预热 HBSS 倒入无菌的 6 cm 和 10 cm 培养皿中，以覆盖皿底表面。每两个大脑准备一个 10 cm 培养皿，另加一个 6 cm 培养皿。
3. 每个 10 cm² 培养皿中最多放置 2 个大脑（图 1A）。
4. 在解剖显微镜下，使用弯头和直头镊子沿中线分离大脑皮层，并分离小脑与脑干。每个大脑可获得三部分组织（图 1B）。
5. 用镊子剥离每部分组织上带有血管的薄而半透明的组织层（脑膜），弃去该层，并将剩余组织转移至另一个培养皿中。用镊子夹住组织切面暴露出的薄层，小心拉扯，直至大部分组织“悬垂”于脑组织之外，最后轻轻拉拽将其完全去除。参见 图 1C-1E 中该步骤前、中、后的代表性图像。
6. 在生物安全柜中，从培养皿中移除残留的 HBSS，小心保留组织。用手术刀将组织切碎，并将组织转移至预热的含胰蛋白酶的 15 mL 离心管中。
7. 将该离心管置于 37 °C 水浴中孵育 25 分钟，以进行酶消化处理。
8. 在室温下以 500 × g 离心 2 分钟，倾去上清液。
9. 使用 10 mL 移液管，加入 10 mL 预热的 DMEM/F12 以灭活胰蛋白酶，并吹打溶液 5 次以进一步分散组织。
10. 在室温下以 500 × g 离心 2 分钟，倾去上清液。
11. 使用 10 mL 移液管将沉淀重悬于 10 mL 预热的 DMEM/F12 中，并将悬液转移至 50 mL 锥形离心管中。
12. 使用带 18 号针头的 10 mL 注射器，吹打悬液 3 次。
13. 按每大脑 12.5 mL 预热 DMEM/F12 的量分装该悬液。
14. 用移液器将吹打后的悬液以每 1 mL 分装至 12 孔板中（每大脑 1 孔）。
15. 在 37 °C、5% CO₂ 的湿润细胞培养箱中孵育。三天后更换培养基，此后每隔三天更换一次培养基。两周后，细胞可用于实验。

2. 大分子单体的合成

1. 在50 mL锥形离心管中称取375 mg透明质酸（HA）盐，并加入37.5 mL蒸馏水。
2. 用涡旋振荡器处理溶液1分钟，然后超声处理混合物，直至溶液呈现均匀状态并失去凝胶状黏度。此过程可能需要6小时。
3. 将溶液转移至含有磁力搅拌子（38 mm）的100 mL烧杯中，在室温下剧烈搅拌。
4. 小心地向混合的HA溶液中滴加5.0 M NaOH，并用pH试纸测量，直至pH稳定在8至12之间。
5. 收集3 mL新鲜的甲基丙烯酸酐（MA，94%），储存时需以氮气覆盖。
   注意：若MA长时间（数天）暴露于空气中，会失去反应活性。
   警告：所有MA操作均应在通风橱中进行。
6. 向混合的HA溶液中加入200 µL MA。该反应会使溶液pH降至8以下。
7. 重复步骤2.4至2.6，直至将3 mL MA全部加入溶液中。此过程可能需要1至2小时。
8. 将反应液在4 °C下静置过夜，不进行搅拌。
9. 将溶液转移至盛有400 mL冷乙醇（EtOH）的500 mL烧杯中，在4 °C下沉淀24至72小时。
10. 小心倾去大部分溶液至另一烧杯中以待处理，将沉淀物收集至50 mL锥形离心管中。必要时可分装至2–4个离心管中。
11. 在室温下以200 × g离心2分钟，弃去上清液。
12. 用冷EtOH补满离心管，用涡旋振荡器混合1分钟，重复步骤2.10–2.11。
13. 加入25 mL无菌去离子水，用涡旋振荡器混合1分钟，超声处理（>20 kHz）1小时，然后在4 °C下过夜孵育。
14. 将溶液置于-80 °C冰箱中冷冻15分钟或直至完全冻结，或在液氮中快速冷冻。
    警告：使用液氮时，应佩戴防护手套、面罩和围裙。
15. 冷冻干燥（压力低于0.1 mBar，温度低于-30 °C）24至48小时，直至形成雪状粉末。
16. 此时可通过¹H核磁共振检测样品纯度，确认HA主链上甲基丙烯酸酯质子（6.1和5.6 ppm处峰）相对于甲基质子（1.9 ppm）的比例。甲基丙烯酸酯质子与甲基质子的最小比值达到95%即可接受。

3. 凝胶形成与三维封装

1. 盖玻片与模具准备
   1. 在50 mL锥形离心管中，配制50 mL含2% 3-(Trimethoxysilyl) propyl methacrylate的蒸馏水溶液。
   2. 将18 mm玻璃盖玻片置于溶液中，室温下振荡处理1小时。可同时加入最多50片盖玻片。
   3. 通过将每个盖玻片依次浸入3个盛有100 mL去离子水的烧杯中，进行冲洗。
   4. 在40 °C下，使用干燥器和烘箱对盖玻片进行真空干燥过夜。
   5. 用镊子将单个盖玻片迅速浸入70%乙醇中。
   6. 无需干燥，直接将每张盖玻片放入12孔板的孔中。
   7. 用无菌去离子水洗涤并抽吸每个孔（每孔 1 mL）。
   8. 向每个孔中加入1 mL无菌的2 µg/mL多聚-L-赖氨酸（PLL），孵育 >2 h
   9. 吸除PLL溶液，让盖玻片自然风干。
   10. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具浸入（参见 图2) 于70%乙醇中，将一个置于每张盖玻片中央，静置风干，使模具与玻璃之间形成密封。
       1. 以10:1的比例将PDMS预混试剂倒入平底聚苯乙烯培养皿中制备PDMS模具。所制备的PDMS用量应足以形成厚度约为1 mm的片状结构。为在PDMS中形成孔洞，使用内径为10 mm的圆形打孔器对PDMS片进行切割。
2. 细胞制备
   ​注意： 所有步骤均在生物安全柜中以无菌技术进行。所有步骤中使用的磷酸盐缓冲液（PBS）均调节至 pH 7.4。
   1. 在甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）包封细胞前24 h，更换12孔板中第2周原代培养物（来自步骤1.15）的培养基。每孔加入1 mL DMEM/F12培养基（含10% FBS和1% PS）。
   2. 为每块12孔板的细胞准备12.5 mL稀释胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-EDTA用DMEM/F12培养基稀释至30%），以及25 mL DMEM/F12培养基（含10% FBS和1% PS），置于37 °C水浴中预热。
   3. 使用10 mL血清移液管从培养板中收集条件培养基（> 每孔加入0.5 mL，充分吸除残留液体，每孔更换为1 mL稀释胰蛋白酶（0.075%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸[EDTA]），于培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育20–30 min₂直至融合的细胞层从培养板上脱落。
   4. 用1 mL移液器回收悬浮的细胞材料（呈单个漂浮团块），收集至15 mL锥形离心管中。加入等体积的DMEM/F12（含10% FBS和1% PS）稀释，于室温下以200 × g离心2 min，弃去上清液。
   5. 将细胞沉淀重悬于10 mL预热的DMEM/F12培养基（含10% FBS和1% PS）中，用10 mL移液管吹打5次，然后在200 × g下离心2分钟。
   6. 弃去上清液，用5 mL温热的DMEM/F12重悬细胞，转移至50 mL锥形离心管中。
   7. 使用一个10 mL注射器连接18号针头，将细胞溶液吹打3次，然后通过40 µm细胞筛过滤悬液至新的锥形离心管中。
   8. 收集10 µL细胞悬液，用预热的DMEM/F12培养基按1:100稀释，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
   9. 在37 °C水浴中孵育，直至进行包封步骤。
3. 细胞封装
   ​注意： 所有步骤均需在生物安全柜中采用无菌技术进行。
   1. 对于每块含3D水凝胶的12孔板，将细胞制备过程中收集的12.5 mL DMEM/F12和12.5 mL条件化DMEM/F12培养基预热。
   2. 称取所需量的HAMA，使其终浓度为0.5%（wt/vol）。将上述HAMA溶于无菌过滤的PBS中，配制成2%（wt/vol）的溶液；该浓度为终浓度的4倍，以预留细胞及其他试剂的添加体积。制备一个12孔板的水凝胶约需含7 mg HAMA的PBS溶液350 µL。
   3. 超声处理（>20 kHz）溶液中，直至HAMA完全溶解，持续60分钟。
   4. 分别配制三乙醇胺（TEA）和1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）的10%溶液，以及伊红Y（EY）的1 mM溶液，均用1 mL无菌PBS（pH 7.4）分装。
   5. 对于一个12孔板，制备终体积为1.4 mL的混合液，其中含有1 × 10⁶ 个细胞/mL⁷ 细胞，0.5% wt/vol HAMA（350 µL 的 2% wt/vol 溶液），0.1% TEA（14 µL 的 10% 溶液），0.1% NVP（14 µL 的 10% 溶液），0.01 mM EY（14 µL 的 1 mM 溶液），以及 20% 基底膜混合物（280 µL 储备液）。其余体积用 PBS 补足。
   6. 轻轻混匀溶液，用1 mL枪头将100 µL溶液移入每个PDMS模具中。
   7. 将样品置于密闭的20 cm × 20 cm × 20 cm盒内，用高强度绿色LED光（~520 nm，60 mW）在室温下照射5分钟。
   8. 向12孔板的每个孔中加入1 mL预热的DMEM/F12完全培养基。
   9. 用拇指和食指夹住每张盖玻片，用弯头镊子小心地缓慢剥离PDMS模具，注意不要移动凝胶，然后将其放入含有预温培养基的孔板孔中。
   10. 每孔加入额外的1 mL温热DMEM/F12。
   11. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板₂ 连续培养2周，每周通过移液从每个孔中取出1 mL培养基，并补充1 mL DMEM/F12。

结果

图1：出生第1天Sprague Dawley大鼠幼鼠脑组织的解剖。 全脑图像（A），大脑皮层与小脑的分离过程（B），带有脑膜的单侧大脑皮层（C），使用镊子剥离脑膜（D），以及去除脑膜后的大脑皮层（E）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. HAMA 合成与光聚合所需材料
透明质酸（HA）	Sigma-Aldrich	53747-10G	来源于 Streptococcus equi，分子量：1.5 - 1.8 × 10⁶
甲基丙烯酸酐（MA）	Sigma-Aldrich	275585-100ML
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	221465-25G
乙醇（EtOH）	Commerical Alcohols Inc.		无水
磷酸盐缓冲液（pH 7.4）片剂	Fisher Scientific	18912014
三乙醇胺（TEA）	Sigma-Aldrich	90279-100ML
1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）	Sigma-Aldrich	V3409-5G
伊红Y（EY）	Sigma-Aldrich	E6003-25G
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard 184 硅胶弹性体套件	Dow Corning
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯	Sigma-Aldrich	440159-100ML
烧杯（100 mL）	Corning	1000-100
烧杯（500 mL）	Corning	1000-600
pH 试纸（Labstick）	Sigma-Aldrich	9580
2. 胶质细胞分离与细胞培养所需材料
P1-2 龄 Sprague Dawley 大鼠幼崽	Charles River	CD Sprague Dawley 大鼠品系编号 001
解剖剪刀 - 细刃（小号）	Fine Science Tools	14081-09
手术剪刀 - Toughcut（大号）	Fine Science Tools	14130-17
精细镊子（Dumont #5）	Fine Science Tools	11521-10
弯头精细镊子（Dumont #7）	Fine Science Tools	11271-30
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14170-112
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 Ham's F-12 营养混合物）	Gibco	11320-033
青霉素-链霉素（PS）	Gibco	15140-122
胎牛血清（FBS）	Gibco	12483-020
0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）	Gibco	25200-072
聚-L-赖氨酸（PLL）	Sigma-Aldrich	P-6282
50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	05-539-13
15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	05-539-5
12 孔组织培养处理板（Cellstar）	Greiner Bio-One	665 108
10 mL 移液管	Fisher Scientific	13-676-10F
25 mL 移液管	Fisher Scientific	12-676-10K
培养皿（60 mm × 15 mm）	Fisher Scientific	FB0875713A
培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher Scientific	FB0875712
显微镜盖玻片（18 mm）	Fisher Scientific	12-545-100 18CIR