利用人多能干细胞生成与维持星形胶质细胞球

摘要

来源：Cvetkovic, C., 等. 利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型. J. Vis. Exp. (2018).

该视频展示了一种利用人多能干细胞的前体细胞生成星形胶质球体的方法。该方法包括在含有生长因子和激酶抑制剂的营养培养基中培养并扩增干细胞。随后这些细胞聚集并分化为星形胶质细胞，形成星形胶质球体。

方案

1. 细胞培养与试剂制备

1. 准备用于细胞培养的包被板。
   1. 将细胞外基质（ECM）包被溶液用DMEM/F12培养基稀释，配制浓度为1 mg/mL的储存液。将稀释后的ECM储存液分装至30个锥形管中，每管3 mL，并立即于-20 °C保存。使用前，取3 mL ECM储存液加入33 mL预冷的DMEM/F12培养基中，终体积为36 mL，得到浓度为80 µg/mL的工作液。
   2. 用ECM工作液以每孔1 mL的量包被6孔细胞培养板。必要时，每孔额外加入1 mL DMEM/F12，以确保孔表面完全被覆盖。将包被好的6孔板在室温下静置至少1小时后使用。
      ​注意：包被板可在培养箱或4 °C条件下保存，最长可达2周。
2. 配制培养基、生长因子和小分子。
   1. 配制500 mL人多能干细胞（hPSC）培养基时，按照生产商说明书添加20x和500x补充剂。
   2. 配制500 mL神经培养基（NM）时，加入肝素至终浓度为2 mg/mL，添加1x抗生素/抗真菌溶液、1x B27补充剂或1x N2补充剂至含L-谷氨酰胺补充剂的500 mL DMEM/F12培养基中，具体如前所述。
   3. 配制10 mM（1,000x）浓度的Rho激酶抑制剂Y27632（Y）储存液：将10 mg粉末溶于3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。过滤除菌、分装并储存在-20 °C。使用时在培养基中的工作浓度为10 µM。
   4. 配制20 mM（10,000x）浓度的SB431542储存液：将10 mg粉末溶于1.3 mL二甲基亚砜（DMSO）中；配制2 mM（1,000x）浓度的DMH1储存液：将10 mg粉末溶于13.1 mL DMSO中。分别过滤除菌、分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度均为2 µM（NM + SB431542 + DMH1）。
      注意：本方案推荐SB431542和DMH1的工作浓度均为2 µM，依据为我们的观察结果及他人报道，该浓度可有效促进hPSC向神经方向诱导。也有文献报道使用更高浓度30。此外，在其他培养体系中已有研究表明，小分子并非实现高效神经转化所必需。因此，最佳工作浓度可能因不同的细胞培养环境而异，需由研究人员根据具体情况优化测试。
   5. 分别配制100 µg/mL（10,000x）浓度的表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF2）储存液：将各1 mg粉末分别溶于10 mL PBS + 0.1% BSA中。将EGF和FGF2储存液分装为50 µL/管，于-80 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为10 ng/mL；例如，向50 mL NM中加入5 µL EGF和5 µL FGF2（NM + EGF + FGF2）。
   6. 配制盐酸多西环素（Dox）储存液时，先将粉末溶于DMSO中至100 mg/mL，于-20 °C保存；再将其稀释为2 mg/mL（1,000x）的PBS溶液，同样于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为2 µg/mL；例如，向50 mL NM中加入50 µL Dox（NM + Dox）。
      注意：溶液解冻后不得再次冷冻。

2. 由人诱导性多能干细胞（hPSCs）生成神经亚型

注意：所有细胞培养物均应在含5% CO2、37 °C的培养箱中培养。这些培养物维持在室温氧水平下，但也可使用较低的氧浓度。

1. 从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持星形胶质细胞前体细胞（hAstros）。
   注意：本节提供了一个简要且简化的分化方案。如需详细描述（包括拟胚体形成、神经玫瑰花环筛选和区域模式化步骤），请参考先前描述的方案 （图1A，绿色虚线框）。
   1. 将hPSC细胞团簇 （图1B） 接种至经细胞外基质（ECM）包被的6孔板中，每孔加入2 mL含Y的hPSC培养基。每日换液，直至细胞融合度达到约50%，根据需要进行传代。
      1. 传代hPSC时，向孔中加入1 mL传代试剂，1分钟后吸除，室温孵育5分钟，加入1 mL hPSC培养基，将细胞团以1:10比例传代至新的ECM包被孔中，每孔加入2 mL含Y的hPSC培养基。
   2. 维持干细胞培养至融合度约50%后，更换为NM + SB431542 + DMH1培养基以诱导神经分化（第0天）。当细胞融合度达到约95%时，以1:6比例传代至新的ECM包被孔中，使用相同培养基。
   3. 第14天，使用解离溶液将细胞解离，并转移至未包被的培养瓶中，加入Y以促进细胞团聚形成。
      注意：添加Y有助于提高细胞存活率并促进球体形成，但并非每次换液均需添加。
   4. 如需生成神经前体细胞和神经元（hNeurons），可使用以下所述的第14天细胞。或者，在神经元成熟或胶质发生开始之前，也可在更晚时间点从单层或球体培养物中使用这些细胞。
      注意：默认情况下，本方案生成的是背侧皮层来源的星形胶质细胞。然而，如需获得特定区域亚型的星形胶质细胞，可通过添加模式化形态发生素进行区域特异性诱导。例如，添加视黄酸（RA）可使细胞向脊髓表型尾侧化，而音猬因子（SHH）、平滑受体激动剂（SAG）或purmorphamine则可诱导腹侧表型。
   5. 如需在自发形成的三维细胞团（hAstrospheres）中生成星形胶质前体细胞和星形胶质细胞，更换为NM + EGF + FGF2培养基，并按周换液（或根据需要维持稳定的pH值），具体操作如前所述。
      1. 当细胞团中心出现深色区域时，使用解离溶液轻柔解离hAstro细胞团，并移除自发贴壁的球体。每周轻柔吹打破碎球体一次，以维持球体健康，避免形成坏死核心。
         注意：解离溶液处理时间不得超过5分钟。
      2. 经过4–6个月的扩增后，确认细胞身份，随后可选择按照制造商说明使用冻存培养基冻存，或采用其他适宜条件长期保存于液氮中，也可立即用于实验。

结果

图 1： 由人多能干细胞（hPSCs）分化形成三维神经球的逐步示意图。（A）本实验方案关键步骤的时间线。（B）可由人诱导性多能干细胞（hPSCs）生成纯度较高的神经细胞群体。如需生成星形胶质细胞前体（绿色虚线框），参见步骤 2.1。（C）通过诱导表达神经源性因子 2（neurogenin 2）从转基因 hPSCs 生成的可诱导神经元（iNeurons；见第 2.2 节），在二维细胞外基质（ECM）上表现出典型的神经元形态（第 7 天），且 MAP2 染色呈阳性（插图）。（D）从微孔板中取出的神经球大小均一，适用于高通量筛选。如需防止球体融合，可将其培养于旋转烧瓶式生物反应器中。比例尺 = 50 µm（C，插图）；比例尺 = 200 µm（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔板	Fisher Scientific	08-772-1B
15 ml 圆底离心管	Olympus Plastics	28-101
Accutase	Sigma	A6964-100ML	细胞解离溶液
AggreWell 板	Stemcell Technologies	34850
防黏附冲洗液	Stemcell Technologies	7010	防止细胞黏附至微孔板
Anti/anti	Thermofisher	15240062
B27	Thermofisher	17504044	培养基添加剂
BrainPhys 神经元培养基	Stemcell Technologies	5790	神经生理学基础培养基替代品
Cryostor CS10	Stemcell Technologies	7930	含 10% DMSO 的冻存培养基
DMEM/F12	Thermofisher	10565-042	含 GlutaMAX 添加剂
DMH-1	Stemcell Technologies	73634	危险：吞咽有毒。工作浓度：2 µM
盐酸多西环素（Dox）	Sigma	D3072-1ml	危险：对孕妇有毒。工作浓度：2 µg/mL
表皮生长因子（EGF）	Peprotech	AF-100-15	工作浓度：10 ng/mL
成纤维细胞生长因子-2（FGF）	Peprotech	100-18B	工作浓度：10 ng/mL
血细胞计数板或自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAX1000
Matrigel 基底膜基质	Corning	354230	ECM 包被溶液。工作浓度：80 µg/mL。需在冰上配制，并确保移液器、离心管和培养基预先冷却。
封片液
N2	Thermofisher	17502048	培养基添加剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Stemcell Technologies	CA008-300
ReLeSR	Stemcell Technologies	5872	细胞解离与传代试剂
Rho激酶抑制剂 Y27632-（Y）	Tocris	1254	工作浓度：10 µM
SB431542	Stemcell Technologies	72234	工作浓度：2 µM
T25 培养瓶	Olympus Plastics	25-207	透气盖
T75 培养瓶	Olympus Plastics	25-209	透气盖