使用人类多能干细胞生成和维持 Astrospheres

Abstract

来源:Cvetkovic， C. 等人 突触微电路建模与来自人类多能干细胞的星形胶质细胞和神经元的 3D 共培养。 （2018 年）。

该视频演示了一种从人类多能干细胞的祖先生成天体球的方法。它涉及干细胞的生长和增殖，其中含有生长因子和激酶抑制剂的营养培养基。然后这些细胞聚集并分化成星形胶质细胞，形成星形球。

Protocol

1. 细胞培养和试剂制备

1. 准备用于细胞培养的包被板。
   1. 用 DMEM/F12 培养基稀释细胞外基质 （ECM） 包被溶液，制备 1 mg/mL 储备液。将稀释的 ECM 储备液分装到 30 个锥形管中，每个锥形管 3 mL，并立即储存在 -20 °C 中。对于工作溶液，将 3 mL ECM 储备液重悬到 33 mL 预冷的 DMEM/F12 培养基中，使总体积达到 36 mL，浓度为 80 μg/mL。
   2. 在 6 孔细胞培养板中每孔涂覆 1 mL，加入 ECM 工作溶液。每孔额外添加 1 mL DMEM/F12（如有必要），以确保孔表面被完全覆盖。使用前，让包被的 6 孔细胞培养板在室温下放置至少 1 小时。
      注:涂层板可在培养箱中或在 4 °C 下储存长达 2 周。
2. 制备培养基配方、生长因子和小分子。
   1. 要制备 500 mL 人多能干细胞 （hPSC） 培养基，请根据制造商的说明添加 20x 和 500x 补充剂。
   2. 要制备 500 mL 神经培养基 （NM），将肝素添加至终浓度为 2 mg/mL、1x 抗生素/抗真菌溶液、1x B27 补充剂或 1x N2 补充剂到一瓶 500 mL DMEM/F12 中，含 L-谷氨酰胺补充剂，如前所述。
   3. 要制备 10 mM （1,000x） Rho 激酶抑制剂 Y27632 （Y） 储备液，请将 10 mg 粉末添加到 3 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。过滤、灭菌、分装并储存在 -20 °C。在培养基中以 10 μM 工作浓度使用。
   4. 要制备 20 mM （10,000x） SB431542储备液，请将 10 mg 粉末添加到 1.3 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中。要制备 DMH1 的 2 mM （1,000x） 储备液，请将 10 mg 粉末添加到 13.1 mL DMSO 中。过滤、灭菌、等分并储存在 -20 °C 下。在培养基中以 2 μM 工作浓度 （NM + SB431542 + DMH1） 使用每种溶液><。 注意: 该方案根据我们的观察和其他人的报告推荐 SB431542 和 DMH1 的 2 μM 工作浓度，这些报告指出该浓度可有效促进 hPSC 的神经诱导。据报道，浓度也更高30。此外，使用替代培养基，还表明小分子对于高神经转化率不是必需的。因此，工作浓度会因替代细胞培养环境而异，最佳浓度应由个体研究人员测试。
   5. 要制备表皮生长因子 （EGF） 和成纤维细胞生长因子-2 （FGF2） 的单独 100 μg/mL （10,000x） 储备液，请将 1 mg 分别添加到 10 mL PBS + 0.1% BSA 中。将 EGF 和 FGF2 储备液分装成 50 μL 等分试样，并储存在 -80 °C。在培养基中以 10 ng/mL 工作浓度使用每种溶液;例如，将 5 μL EGF 和 5 μL FGF2 添加到 50 mL NM （NM + EGF + FGF2） 中。
   6. 要制备盐酸多西环素 （Dox） 的储备溶液，首先将粉末溶解在 DMSO 中至 100 mg/mL，并储存在 -20 °C。此外，将其稀释成 2 mg/mL （1,000x） 的 PBS 储备液，并储存在 -20 °C 下。在培养基中以 2 μg/mL 工作浓度使用;例如，将 50 μL Dox 添加到 50 mL NM （NM + Dox） 中><。 注意: 解冻后不要重新冷冻溶液。

2. 从人诱导多能细胞 （hPSC） 产生神经亚型

注意:所有细胞培养物都应保存在 37 °C 下含 5% CO2 的培养箱中。这些培养物维持在室氧水平，但可以使用较低的水平。

1. 从 hPSCs.
   产生并维持星形胶质细胞祖细胞 （hAstros） 注意: 本节提供了一个简短而简化的区分方案。有关详细说明（包括胚状体形成、玫瑰花结选择和区域图案化步骤），请参阅前面描述的协议（图 1A，绿色虚线框）。
   1. 将 hPSC 的种子簇（图 1B）接种到 ECM 包被的 6 孔板（参见步骤 1.1）上，每孔含有 2 mL hPSC 培养基 + Y。每天喂养干细胞，直到它们汇合约 50% 并根据需要分裂。
      1. 要分离 hPSC，向孔中加入 1 mL 传代试剂，并在 1 分钟后吸出。在室温下孵育细胞 5 分钟，加入 1 mL hPSC 培养基，并以 1:10 的比例将聚集体分流到每孔 2 mL hPSC 培养基 + Y 中的新 ECM 包被孔上。
   2. 维持干细胞直到它们达到约 50% 汇合，然后将培养基更换为 NM + SB431542 + DMH1 以诱导神经分化（第 0 天）。当细胞汇合度约为 95% 时，以 1:6 的比例分液到相同培养基中新的 ECM 包被孔中。
   3. 第 14 天，用分离溶液解离细胞，并将它们转移到带有 Y 的未包被的培养瓶中，以促进聚集体的形成><。 注意: Y 的添加用于促进细胞存活和球体形成，但并非每次补料都包括在内。
   4. 对于神经元祖细胞和神经元 （hNeurons） 的产生，请使用这些第 14 天细胞，如下所述。或者，在神经元成熟发生或胶质生成开始之前，在稍后的时间点利用来自单层或球形培养物的这些细胞><。 注意: 默认情况下，该协议产生背侧皮质星形胶质细胞。然而，如果需要，可以通过添加模式形态发生素在区域上指定星形胶质细胞亚型。可以添加视黄酸 （RA） 以将细胞尾部化为脊髓表型，而声波刺猬 （SHH）、平滑激动剂 （SAG） 或嘎嘎胺将产生腹侧表型。
   5. 为了在自发形成的 3D 聚集体 （hAstrospheres） 中产生星形胶质细胞祖细胞和星形胶质细胞，切换到 NM + EGF + FGF2 并每周喂食（或根据需要确保稳定的 pH 值），如前所述。
      1. 当暗中心出现时，用分离溶液轻轻解离 hAstro 聚集体，并去除自发附着的球体。每周轻轻打碎球体一次，以保持球体健康并避免核心坏死。
         注意: 用分离溶液处理的时间不要超过 5 分钟。
      2. 扩增 4-6 个月后，确认细胞身份，并在冻存培养基中冷冻（根据制造商的说明）或其他储存条件，以便在液氮中长期保存或立即用于实验。

Results

图 1: 逐步描绘源自 hPSC 的 3D 神经球的分化和形成。（A） 协议中关键步骤的时间表。（B） 纯神经细胞群可以从人诱导的多能干细胞 （hPSC） 中产生。关于星形胶质细胞祖细胞的产生（绿色虚线框），参见步骤 2.1。（C） 通过诱导过表达神经生成素 2 从转基因 hPSC 产生的诱导型神经元（iNeurons;参见第 2.2 节）在 2D ECM 上（第 7 天）上表现出神经元形态，并且对 MAP2 呈阳性（插图）。（D） 从微孔板中取出的球体表现出一致的大小，可用于高通量筛选。如果需要，可以在旋转瓶生物反应器中培养球体以防止融合。比例尺 = 50 μm（C，插图）。比例尺 = 200 μm （A， D）。

Materials