非转基因与转基因人类多能干细胞向神经前体细胞的分化

摘要

来源：Cvetkovic, C.，等。利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了如何从非转基因和转基因的人类多能干细胞（hPSCs）生成神经前体细胞。通过使用神经分化培养基，将hPSCs分化为神经前体细胞。在非转基因细胞中，使用小分子诱导分化；而在转基因hPSCs中，则通过添加抗生素来激活神经分化特异性转录因子的启动子，从而诱导其分化。

方案

进行实验时已获得伦理批准。

1. 细胞培养与试剂配制

1. 准备用于细胞培养的包被板。
   1. 用杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）稀释细胞外基质（ECM）包被液，配制浓度为1 mg/mL的储存液。将稀释后的ECM储存液分装至30个锥形管中，每管3 mL，立即于-20 °C保存。使用前，将3 mL ECM储存液加入33 mL预冷的DMEM/F12培养基中，总体积为36 mL，得到浓度为80 µg/mL的工作液。
   2. 用ECM工作液以每孔1 mL的量包被6孔细胞培养板。每孔额外加入1 mL DMEM/F12（如需要），以确保孔表面完全被覆盖。将包被好的6孔板在室温下静置至少1小时后使用。
      注意： 包被板可在培养箱或4 °C条件下保存最多2周。
2. 准备培养基配方、生长因子和小分子化合物。
   1. 配制500 mL人多能干细胞（hPSC）培养基时，根据生产商说明书添加20x和500x补充剂。
   2. 配制500 mL神经培养基（NM）时，在含L-谷氨酰胺补充剂的500 mL DMEM/F12培养基中加入肝素至终浓度为2 mg/mL，以及1x抗生素/抗真菌溶液、1x B27补充剂或1x N2补充剂，具体如前所述。
   3. 配制10 mM（1,000倍）Rho激酶抑制剂Y27632（Y）储存液：将10 mg粉末溶于3 mL磷酸缓冲盐水（PBS）中。过滤除菌后分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为10 µM。
   4. 配制20 mM（10,000倍）SB431542储存液：将10 mg粉末溶于1.3 mL二甲基亚砜（DMSO）中。配制2 mM（1,000倍）DMH1（4-[6-(4-异丙氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉，4-[6-[4-(1-甲基乙氧基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉）储存液：将10 mg粉末溶于13.1 mL DMSO中。上述溶液均需过滤除菌、分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度均为2 µM（NM + SB431542 + DMH1）。
      注意： 本方案推荐SB431542和DMH1的工作浓度均为2 µM，依据是我们观察结果及他人报道，该浓度可有效促进hPSC向神经细胞诱导。也有文献报道使用更高浓度。此外，在其他培养基体系中，已有研究表明小分子并非实现高效神经转化所必需。因此，工作浓度可能因不同的细胞培养环境而异，最佳浓度应由研究人员自行测试确定。
   5. 配制盐酸多西环素（Dox）储存液时，先将粉末溶于DMSO中至100 mg/mL，于-20 °C保存。再进一步稀释为2 mg/mL（1,000倍）的PBS溶液，同样于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为2 µg/mL；例如，向50 mL NM中加入50 µL Dox（NM + Dox）。
      注意： 溶液解冻后不得再次冷冻。

2. 由人诱导性多能干细胞（hPSCs）生成神经亚型

注意：所有细胞培养均应在含5% CO₂、37 °C的培养箱中进行。这些培养物维持在室温氧水平下，但也可使用较低的氧浓度。

1. 从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持星形胶质细胞前体细胞（hAstros）。
   注意：本节提供一个简要且简化的分化方案（图1A，绿色虚线框）。
   1. 将hPSC细胞团（图1B）接种至包被了细胞外基质（ECM）的6孔板中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y。每天换液，直至细胞汇合度达到约50%，根据需要进行传代。
      1. 传代hPSC时，向孔中加入1 mL传代试剂，1分钟后吸除；室温孵育5分钟，加入1 mL hPSC培养基，将细胞团块以1:10比例传代至新的ECM包被孔中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y。
   2. 维持干细胞培养至汇合度约50%后，更换为NM + SB431542 + DMH1培养基，以诱导神经分化（第0天）。当细胞汇合度达到约95%时，以1:6比例传代至新的ECM包被孔中，使用相同培养基。
   3. 第14天，使用解离溶液将细胞解离，并转移至未包被的培养瓶中，加入Y以促进细胞团形成。
      注意：添加Y有助于提高细胞存活率并促进球状体形成，但并非每次换液均需添加。
   4. 如需生成神经前体细胞和神经元（hNeurons），可使用第14天的细胞，按照转基因细胞的分化方法进行后续操作。
2. 从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持可诱导神经元（iNeurons）。​
   1. 将转基因hPSCs（稳定表达强力霉素诱导型神经源性分化因子2转基因）接种至ECM包被的6孔板中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y（接种方法同非转基因细胞系所述）。每孔每天更换2 mL培养基，直至细胞在汇合度约70%时准备进行处理。传代方法同上。
   2. 当细胞汇合度约为35%时，加入NM + Dox以诱导分化为iNeurons。
      注意：细胞将转变为神经前体细胞，但尚未开始延伸神经突。

结果

图 1：人多能干细胞（hPSCs）来源的三维神经球分化与形成的逐步示意图。（A）本实验方案关键步骤的时间线。（B）可由人诱导性多能干细胞（hPSCs）生成纯度较高的神经细胞群体。（C）通过诱导表达神经源性因子 2 实现转基因 hPSCs 向可诱导神经元（iNeurons；见第 2.2 节）的转化，其在二维细胞外基质（ECM）上呈现典型的神经元形态（第 7 天），且 MAP2 染色呈阳性（插图）。（D）从微孔板中取出的神经球大小均一，适用于高通量筛选。如需防止神经球融合，可将其培养于旋转烧瓶式生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔板	Fisher Scientific	08-772-1B
15 mL 圆锥形离心管	Olympus Plastics	28-101
Accutase	Sigma	A6964-100ML	细胞解离溶液
B27	Thermofisher	17504044	培养基添加剂
BrainPhys 神经元培养基	Stemcell Technologies	5790	神经生理学基础培养基替代品
DMEM/F12	Thermofisher	10565-042	含 GlutaMAX 添加剂
DMH-1	Stemcell Technologies	73634	危险：吞咽有毒。工作浓度：2 μM
盐酸多西环素（Dox）	Sigma	D3072-1ml	危险：对孕妇有毒。工作浓度：2 μg/mL
血细胞计数板或自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAX1000
肝素	Sigma	H3149-50KU	工作浓度：2 mg/mL
Matrigel 基底膜基质	Corning	354230	细胞外基质包被溶液。工作浓度：80 μg/mL。需在冰上配制，并确保移液器、离心管和培养基预先冷却。
N2	Thermofisher	17502048	培养基添加剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Stemcell Technologies	CA008-300
多聚-L-鸟氨酸（PLO）	Sigma	P3655-100MG	工作浓度：0.5 mg/mL
ReLeSR	Stemcell Technologies	5872	细胞解离与传代试剂
Rho激酶抑制剂 Y27632-（Y）	Tocris	1254	工作浓度：10 μM
SB431542	Stemcell Technologies	72234	工作浓度：2 μM
T25 培养瓶	Olympus Plastics	25-207	透气盖
T75 培养瓶	Olympus Plastics	25-209	透气盖
TeSR-E8 基础培养基	Stemcell Technologies	5940	人多能干细胞（hPSC）培养基
TeSR-E8 添加剂	Stemcell Technologies	5940	人多能干细胞培养基添加剂
台盼蓝	Invitrogen	T10282