生成星形胶质细胞与神经元的三维共培养球体以诱导突触形成

摘要

来源：Cvetkovic, C.，等。利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种共培养星形胶质细胞与神经元以形成三维球体的方法。这些三维球体为研究突触形成和神经网络整合提供了独特的平台，因而可作为发育神经科学、神经退行性疾病以及神经药理学干预研究的潜在模型。

方案

1. 三维球体共培养物的制备与维护

1. 从悬浮的3D聚集体中解离hAstros。​
   1. 当聚集体出现深色中心时，使用解离液轻柔地解离人星形胶质细胞（hAstro）聚集体，并移除自发贴壁的球状体。每周轻柔地破碎一次球状体，以维持其健康状态并避免形成坏死核心。
      ​注意：使用解离液处理的时间不得超过5分钟。
2. 从2D单层培养物中解离hNeurons或iNeurons。
   1. 从6孔板中移除培养基，并向每孔含有hNeuron（人神经元）或iNeurons（诱导性神经元）单层培养物的孔中加入500 µL解离液。在37 °C下孵育5分钟。轻柔地加入2–3 mL DMEM/F12基础培养基以去除贴壁细胞。
   2. 将细胞和培养基收集至15 mL锥形管中，在300 xg下离心1分钟。吸除上清液，加入1 mL新鲜培养基，并使用1,000 µL移液器轻轻吹打，获得单细胞悬液。
3. 使用微孔培养板形成3D球状体。
   1. 通过向微孔板的每个孔中加入0.5 mL抗黏附冲洗液来准备培养板。在2,000 xg下离心5分钟。吸除冲洗液，向每孔加入1 mL DMEM/F12基础培养基进行洗涤，然后再次吸除。
      注意：使用离心机时务必确保其处于平衡状态。
   2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数器对每种细胞进行计数。将解离后的hAstros与hNeurons或iNeurons按所需比例加入各孔中，总体积为2 mL神经培养基（NM）+ Y（若使用iNeurons，则包含Dox）。在100 xg下离心3分钟，然后放回培养箱。
      注意：24孔微孔板（见材料表）每孔含有300个微孔。每孔在2 mL培养基中至少加入6 × 10⁵个细胞（每个球状体含2 × 10³个细胞），最多加入6 × 10⁶个细胞（每个球状体含2 × 10⁴个细胞）。若需在此范围内获得特定密度的活性球状体，请使用确定数量的细胞并除以300，以计算每个球状体的细胞数。也可根据需要采用其他球状体形成方法和工具。请遵循制造商关于细胞密度可接受范围的说明。
   3. 在接下来的2天内，让细胞在微孔板中自组装成紧密堆积的球状体（图1A）。若培养基变黄，则更换50%的培养基。
      注意：仅更换一半培养基，并在移除和添加培养基时轻柔操作，以免扰动球状体。施加较大力量可能导致球状体从微孔中脱离并相互融合。
   4. 2天后，使用1,000 µL移液器轻柔地将球状体从微孔中移出（图2D）。用培养基轻轻施力于微孔底部，以去除任何额外黏附的球状体。让球状体在15 mL锥形管中沉降，吸除旧培养基，并加入新鲜培养基。
4. 设置用于形成3D球状体的旋转烧瓶生物反应器系统。​
   1. 用70%乙醇清洁磁力搅拌板表面，并将其放入细胞培养箱中。对各个旋转烧瓶进行高压灭菌以实现消毒。
   2. 向每个旋转烧瓶中加入球状体及至少50–60 mL培养基（图2D，插图）。将烧瓶置于设定为60 rpm的磁力搅拌板上。在旋转烧瓶中培养球状体，直至其可用于数据采集。
      注意：形成突触至少需要3周的培养时间。

结果

图1：生物工程化三维神经球的系统性与可重复性生成 (A微孔（µ-孔）培养板可用于系统性地、按用户指定的方式形成具有理想密度和神经元-星形胶质细胞比例的三维神经球，所得神经球大小和形态一致。图像显示神经球形成后1天的结果。比例尺 = 200 µm。 (B) 一系列起始细胞密度（从 4 x 10³ 至 2 × 10⁴ 每微孔细胞数）会产生大小不一的细胞球。若无微孔板，人多能干细胞会聚集成明显更大且不均一的聚集体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔板	Fisher Scientific	08-772-1B
15 ml 圆锥形离心管	Olympus Plastics	28-101
Accutase	Sigma	A6964-100ML	细胞解离液
AggreWell 板	Stemcell Technologies	34850
防黏附冲洗液	Stemcell Technologies	7010	防止细胞黏附至微孔板
Anti/anti	Thermofisher	15240062
B27	Thermofisher	17504044	培养基添加剂
BrainPhys 神经元培养基	Stemcell Technologies	5790	神经生理学基础培养基替代品
DMEM/F12	Thermofisher	10565-042	含 GlutaMAX 添加剂
DMH-1	Stemcell Technologies	73634	危险：吞咽有毒。工作浓度：2 µM
驴血清	Lampire Biological Laboratories	7332100	工作浓度：初级封闭缓冲液中为 5%，次级封闭缓冲液中为 1%
盐酸多西环素（Dox）	Sigma	D3072-1ml	危险：对孕妇有毒。工作浓度：2 µg/mL
表皮生长因子（EGF）	Peprotech	AF-100-15	工作浓度：10 ng/mL
成纤维细胞生长因子-2（FGF）	Peprotech	100-18B	工作浓度：10 ng/mL
血细胞计数板或自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAX1000
Matrigel 基底膜基质	Corning	354230	ECM 包被溶液。工作浓度：80 µg/mL。需在冰上配制，并确保移液器、离心管和培养基预先冷却。
MEA 2100 系统	Multichannel Systems	MEA2100
Rho 激酶抑制剂 Y27632-（Y）	Tocris	1254	工作浓度：10 µM
SB431542	Stemcell Technologies	72234	工作浓度：2 µM
旋转烧瓶	Fisher Scientific	4500-125
T25 培养瓶	Olympus Plastics	25-207	带透气盖
台盼蓝	Invitrogen	T10282