由骨髓基质细胞生成施万细胞样细胞

摘要

来源：Tsui, Y.，等。骨髓来源祖细胞的缺氧预处理作为成熟施万细胞生成的来源。视觉化实验杂志（2017）

本视频展示了一种从多能骨髓基质细胞（BMSCs）获取类似施万细胞的方法。首先，BMSCs接受低氧处理，随后定向分化为神经前体细胞。接着，采用特定的培养基和培养条件，诱导这些前体细胞转化为类似施万细胞的细胞。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 大鼠MSC培养物的制备

1. 从股骨中分离间充质干细胞（MSCs）
   1. 使用前，在180 °C下对所有解剖工具（即精细解剖剪、钝头剪刀和齿状镊）进行高压灭菌，时间不少于2小时。
   2. 配制MSC生长培养基：基础为最低必需培养基-α修饰型（αMEM），添加15%胎牛血清（FBS）以及青霉素/链霉素（P/S，1% v/v）。
   3. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（240 mg/kg体重）处死雄性幼年Sprague Dawley大鼠（体重200–250 g）。
      注意：不同大鼠的骨髓样本应分别处理。
   4. 将处死的动物仰卧放置，用70%乙醇彻底清洁其腹部和下肢。
   5. 使用精细解剖剪和镊子去除大腿内侧的皮肤及皮下组织，环形剥离股骨周围的肌肉组织，直至股骨完全暴露；向近端和远端继续分离，直至可见膝关节和髋关节；使用钝头剪刀在髋关节和膝关节处切断，将股骨整体取下。
      注意：此阶段切勿横断股骨以暴露骨髓腔。将完整的股骨转移至超净台中的生物安全柜内，用于后续操作。
   6. 使用钝头剪刀在干骺端处切断股骨的近端和远端。
   7. 在50 mL锥形离心管上放置70 μm细胞滤器。将装有磷酸盐缓冲液（PBS，10 mM Na₂HPO₄，pH 7.4）的10 mL、21 G注射器插入暴露的股骨髓腔，反复冲洗，将骨髓内容物冲入锥形管中。
      注意：每根股骨约需使用20 mL PBS。若冲洗液仍呈血性浑浊，可适当增加冲洗体积。
   8. 以480 ×g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10 mL MSC生长培养基中，接种至10 cm组织培养皿中。将培养皿置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO₂）。将接种当天记为第0天。
      注意：所有涉及离心的步骤中，均应设置刹车为最大减速档。
2. MSC克隆的建立与扩增
   注意：本方案依赖MSC对组织培养塑料表面的贴壁特性，从骨髓腔内容物中筛选MSC。骨髓内容物需在培养皿中贴壁培养2天。
   1. 第2天，用10 mL PBS清洗培养皿三次，以去除未贴壁细胞。每次清洗后更换为10 mL MSC生长培养基。此后每3天用PBS清洗细胞一次，并补充新鲜MSC生长培养基。
      注意：MSC克隆通常在第6–7天可见（图1A）。
   2. 第10天进行传代：吸除培养基，用PBS清洗细胞，加入1.5 mL重组酶消化液，37 °C孵育5分钟。加入3 mL MSC生长培养基终止消化反应。将脱落的细胞以250 ×g离心5分钟收集。
   3. 用血细胞计数板在PBS适当稀释后对细胞沉淀中的细胞数量进行定量。
   4. 将传代细胞以40,000 个细胞/cm²的密度接种至含MSC生长培养基的10 cm培养皿中。
      注意：大鼠MSC在传代后2天内应达到80–90%融合度（图1B）。细胞可按步骤1.2.2所述方法传代，最多传至第8代。MSC可通过免疫细胞化学染色及三系分化能力进行鉴定（图2）。后续的缺氧预处理和神经前体细胞富集实验仅使用第3至第8代的MSC。更高代次的MSC会呈现扁平化形态（图1C），且无法有效生成神经前体细胞，此类培养物应予以弃用。

2. 人骨髓间充质干细胞培养物的制备

1. 取1 mL人骨髓穿刺液，用9 mL间充质干细胞（MSC）生长培养基稀释后，接种于10 cm组织培养皿中。将细胞培养物置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中维持培养。
2. 培养2天后移除培养基，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗培养物三次，以去除非贴壁细胞。最后一次冲洗后，吸除PBS，并加入10 mL MSC生长培养基。PBS冲洗后，每隔3天更换一次生长培养基。
   注意： 间充质干细胞克隆约在第6–7天可见，不同供体之间的克隆数量可能存在差异。
3. 在第10天按步骤1.2.2所述方法进行细胞传代。用PBS适当稀释后，使用血细胞计数板对沉淀中的细胞进行定量。将传代后的细胞以40,000个细胞/cm²的密度接种至含MSC生长培养基的10 cm培养皿中。
   注意： 人源MSCs（图1D）形态学特征与大鼠MSCs相似，传代后约2天内应达到80–90%汇合度。应通过免疫细胞化学染色及三系分化能力对其特性进行鉴定。与大鼠MSCs相同，人源MSCs在第3至第8代之间可用于后续的低氧预处理及神经前体细胞富集实验。

3. 缺氧预处理

1. 松开环形夹后，拆卸缺氧培养箱的各个组件（即 底座、盖子、托盘），并用70%乙醇清洁各部件。将培养箱组件置于层流超净台内，通过紫外灯照射15分钟进行灭菌。
2. 在进行缺氧预处理前，吸除培养基，并用10 mL PBS冲洗大鼠和人源MSC培养物（第1和第2节）。随后吸除PBS，加入10 mL含25 mM HEPES的MSC生长培养基。
   注意： 接受缺氧预处理前，接种于10 cm培养皿中的MSC应达到80–90%的融合度。
3. 将培养皿放入缺氧培养箱内，重新组装培养箱组件并拧紧环形夹。以10 L/min的流速向培养箱内通入99% N₂/1% O₂ 混合气体，持续5分钟。
4. 密封缺氧培养箱的连接端口，防止气体泄漏。将培养箱置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育16小时。
5. 缺氧预处理完成后，从培养箱中取出细胞培养物，准备进行后续的神经前体细胞富集培养。

4. 神经前体细胞富集培养

1. 准备神经前体细胞培养基，包含添加了B27（2% v/v）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 ng/mL）、表皮生长因子（EGF，20 ng/mL）和青霉素-链霉素溶液（P/S，1% v/v）的杜氏改良伊格尔培养基/汉姆F12营养混合物（DMEM/F12）。
2. 按照步骤1.2.2所述方法消化低氧预处理的大鼠/人源MSCs，通过250 × g离心5分钟收集细胞。用PBS适当稀释后，使用血细胞计数板对沉淀中的细胞进行定量。
3. 将细胞重悬于神经前体细胞培养基中，以6,000个细胞/cm²的密度接种至低吸附性6孔板中。将培养物置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养12天，每3天更换75%的神经前体细胞培养基。
   注意：在第6至7天应可见较大的非贴壁细胞团簇。至第10至12天，可观察到直径≥100 μm的神经球（图3）。与常氧条件下培养的MSCs相比，低氧预处理的MSCs应能形成更多的神经球。
4. 在第12天用10 mL移液管吸取收集神经球，并转移至15 mL锥形离心管中，于250 × g离心5分钟。
   注意：可在第12天对神经球进行神经前体细胞标志物（如nestin和GFAP）的鉴定。

5. 施万细胞样细胞的生成

1. 配制胶质细胞诱导培养基，包含添加了β-Heregulin（100 ng/mL）、bFGF（10 ng/mL）、血小板源性生长因子（PDGF-AA，5 ng/mL）、胎牛血清（FBS，10%）和青霉素-链霉素溶液（P/S，1% v/v）的αMEM培养基。
2. 将第4节制备的神经球接种于多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中，密度为每平方厘米5–10个神经球² 每孔加入1.5 mL胶质细胞诱导培养基。用PBS洗涤细胞后，每2天更换一次胶质细胞诱导培养基。
   注意： 接种后的神经球细胞在第2天可见向外迁移。到第7天时，迁移细胞呈锥形，应表现出对施万细胞标志物p75神经营养因子受体（p75）和S100β的免疫阳性反应。这些细胞被称为SCLCs。

结果

图1：间充质干细胞（MSC）集落的建立。 将骨髓细胞接种至组织培养塑料表面后6-7天，应可见明显大小的MSC集落。图中展示了大鼠MSC集落的代表性图像（A），而人源集落外观相似。集落可在第10天进行传代。在更高放大倍数下观察，大鼠（B）和人（D）MSC在传代后均表现出典型的成纤维细胞样形态。高代次培养的MSC会逐渐呈现扁平、四边形的形态（C），此类细胞应予以弃用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
αMEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
表皮生长因子（EGF）	Thermofisher scientific	PHG0313
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Peprotech	100-18B/100UG
血小板源性生长因子-AA（PDGF-AA）	Peprotech	100-13A
Heregulin beta-3，EGF结构域（β-Her）	Millipore	01-201
聚-D-赖氨酸（PDL）	Sigmaaldrich	P7886-1G
层粘连蛋白	Thermofisher scientific	23017015
青霉素/链霉素（P/S）	Thermofisher Scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher Scientific	12604-013
10 cm贴壁培养板	TPP	93100	用于间充质干细胞（MSCs）的筛选
6孔贴壁培养板	TPP	92006	用于传代后间充质干细胞（MSCs）的扩增
超低吸附6孔非贴壁培养板	Corning	3471	用于神经前体细胞富集
抗人CD90（Thy-1）	BD Biosciences	555593
抗人CD73	BD Biosciences	550256
抗人/大鼠STRO-1	R&D Systems	MAB1038
抗人CD45	BD Biosciences	555480
低氧培养箱	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES缓冲液	Sigmaaldrich	H4034-100G
抗人巢蛋白（nestin）	R&D Systems	MAB1259
抗大鼠CD90（Thy-1）	BD Biosciences	554895
抗大鼠CD73	BD Biosciences	551123
抗大鼠巢蛋白（nestin）	BD Biosciences	MAB1259
抗大鼠CD45	BD Biosciences	554875
抗S100β	Dako	Z031101
抗p75	Millipore	MAB5386
抗GFAP	Sigmaaldrich	G3893
抗III类β-微管蛋白（Tuj-1）	Covance	MMS-435P
抗人细胞核抗原	Millipore	MAB1281