背根神经节神经元的分离及与施万细胞前体共培养以生成施万细胞

摘要

来源：Tsui, Y, 等 将骨髓来源的祖细胞进行缺氧预处理以生成成熟施万细胞的研究。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了从大鼠胚胎中分离背根神经节（DRG）神经元，并将其与施万细胞前体共培养以生成成熟施万细胞的操作流程。分离得到的DRG经过处理以获取神经元和胶质细胞。分离后的细胞通过培养纯化神经元，随后在共培养培养基中与施万细胞样细胞（SCLCs）进行共培养。DRG神经元与SCLCs的相互作用可诱导SCLCs成熟为施万细胞。

方案

通过与背根神经节神经元共培养生成命运限定的施万细胞

1. 纯化大鼠DRG神经元的制备

1. 使用前，将所有解剖工具（即解剖剪、镊子、两把显微解剖镊和显微解剖剪）在180 °C下高压灭菌至少2小时。
2. 用多聚-D-赖氨酸（PDL，10 µg/mL PBS溶液）在4°C下对6孔组织培养板包被过夜。去除PDL，并用每孔1.5 mL PBS冲洗。
3. 接着用层粘连蛋白（laminin，10 µg/mL PBS溶液）在37 °C下包被2小时。用每孔1.5 mL PBS冲洗培养板。
4. 配制背根神经节（DRG）神经元维持培养基，成分为：Neurobasal培养基添加B27（2% v/v）、L-谷氨酰胺（1% v/v）、神经生长因子（NGF，20 ng/mL）和青霉素/链霉素（P/S，1% v/v）。
5. 配制背根神经节（DRG）神经元纯化培养基，成分为：Neurobasal培养基添加B27（2% v/v）、L-谷氨酰胺（1% v/v）、神经生长因子（NGF，20 ng/mL）、P/S（1% v/v）、氟脱氧尿苷（FDU，10 µg/mL）和尿苷（10 µg/mL）。
6. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（240 mg/kg体重）处死妊娠第14-15天的大鼠。
7. 将处死的动物置于仰卧位，用70%乙醇彻底清洁其腹部。
8. 使用精细解剖剪和镊子纵向切开动物下腹部。识别并取出子宫，切开子宫壁以暴露并取出胚胎。将胚胎转移至盛有PBS的无菌10 cm培养皿中，并将培养皿置于冰上。
9. 将用于解剖的胚胎转移至盛有PBS（室温）的无菌10 cm培养皿中，并置于解剖显微镜下，使胚胎呈俯卧位。
   注意：透过胚胎半透明的皮肤，可在其背部观察到白色的脊髓及附着的背根神经节（DRGs）。
10. 用显微解剖镊沿脊髓两侧插入，采用钝性分离法开始将脊髓与周围软组织分离。使用显微解剖镊从颈部开口和尾部残端处剪断，使脊髓完全游离。进一步在脊髓腹侧进行钝性分离，以彻底去除周围软组织。
11. 用显微解剖镊清除已游离脊髓背侧残留的软组织。
    注意：此阶段应仅保留脊髓、神经根及附着的背根神经节（DRG）。
12. 使用显微解剖镊将单个背根神经节（DRG）从其连接的神经根上分离下来。使用连接1 mL吸头的移液器笔将DRG转移至含有PBS的无菌1.5 mL离心管中。
    注意：每个1.5 mL离心管最多可容纳100个DRG。
13. 以250 × g离心DRG 5分钟，弃上清后重悬于重组酶消化液（每管200 µL）。于37 °C、5% CO₂条件下孵育10分钟。再次以250 × g离心5分钟，弃上清，重悬于DRG神经元维持培养基中。使用200 µL移液枪头轻柔吹打，使沉淀细胞充分解离。适当稀释后，使用血细胞计数板对细胞数量进行定量。
14. 将细胞以5,000 cells/cm²的密度接种于PDL/层粘连蛋白包被的6孔板中，每孔加入1.5 mL DRG神经元维持培养基。培养两天后，移除维持培养基，用PBS冲洗，更换为DRG神经元纯化培养基。
    注意：每轮纯化处理中，使用纯化培养基培养2天，随后在维持培养基中孵育1天。经过3-4轮纯化循环后，预期可完全去除内源性胶质细胞。整个过程约需14天。纯化后的培养物神经元标志物TUJ1呈阳性，且无S100β表达（图1）。

2. 雪旺细胞样细胞的制备

1. 配制胶质细胞诱导培养基，其成分为添加了β-Heregulin（100 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10 ng/mL）、血小板源性生长因子（PDGF-AA，5 ng/mL）、胎牛血清（FBS，10%）和青霉素-链霉素溶液（P/S，1% v/v）的αMEM（最小必需培养基Eagle（MEM）α改良型）。
2. 将第4节中制备的神经球以每平方厘米5–10个神经球的密度接种于多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中，每孔加入1.5 mL胶质细胞诱导培养基。用PBS洗涤细胞后，每2天更换一次培养基。
3. 注意：接种后的神经球细胞通常在第2天开始向外迁移。至第7天时，迁移细胞呈现锥形形态，并应表现出对施万细胞标志物p75神经营养素受体（p75）和S100β的免疫阳性反应。此类细胞称为SCLCs。

3. 小细胞肺癌细胞与背根神经节神经元的共培养

1. 按1:1的体积比配制共培养培养基，该培养基由DRG神经元维持培养基（步骤1.1.4）和胶质细胞诱导培养基（步骤1.2.1）组成。
2. 配制施万细胞维持培养基：以Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）为基础，添加5% FBS、10 ng/mL β-Heregulin和1%（v/v）P/S。
3. 从培养7天的SCLC培养物中移除培养基，用PBS清洗，然后每孔加入0.5 mL重组酶解离试剂，在37 °C孵育5分钟。将SCLC重悬于共培养培养基中。
4. 适当稀释后，使用血细胞计数板对细胞进行定量。
5. 以1,000个细胞/cm²的密度将SCLC接种至纯化的DRG神经元培养物上。共培养维持14天，每2天更换一次培养基。
   注意：在共培养过程中，SCLC获得典型的成熟施万细胞的纺锤形形态（图2）。这些细胞在撤除生长因子后仍能维持其表型，并能够在体外和体内髓鞘化轴突。应通过免疫荧光检测施万细胞标志物（如p75和S100β）的表达情况。
6. 共培养结束后，对命运已决定的施万细胞进行传代。每孔使用0.5 mL解离试剂。适当稀释后，使用血细胞计数板对细胞进行定量。

结果

图1： 建立纯化的鼠背根神经节（DRG）神经网络。经过抗有丝分裂试剂FDU和尿苷脉冲处理后，可建立纯化的DRG神经网络（A）。该神经突网络不含表达S100β的内源性胶质细胞（B），可用于与小细胞肺癌细胞（SCLCs）进行共培养。比例尺 = 100 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
αMEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
Neurobasal 培养基	Thermofisher scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
表皮生长因子（EGF）	Thermofisher scientific	PHG0313
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Peprotech	100-18B/100UG
神经生长因子（NGF）	Millipore	NC011
血小板源性生长因子-AA（PDGF-AA）	Peprotech	100-13A
Heregulin beta-3，EGF 结构域（β Her）	Millipore	01-201
尿苷	Sigmaaldrich	U3003
5-氟-2'-脱氧尿苷（FDU）	Sigmaaldrich	F0503
多聚-D-赖氨酸（PDL）	Sigmaaldrich	P7886-1G
层粘连蛋白	Thermofisher scientific	23017015
GlutaMAX	Thermofisher scientific	35050061
青霉素/链霉素（P/S）	Thermofisher scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher scientific	12604-013
10 cm 贴壁培养板	TPP	93100	用于通过组织培养贴壁法筛选间充质干细胞（MSCs）
6 孔贴壁培养板	TPP	92006	用于传代后间充质干细胞（MSCs）的扩增
超低吸附 6 孔非贴壁培养板	Corning	3471	用于神经前体细胞富集
低氧培养箱	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES 缓冲液	Sigmaaldrich	H4034-100G