一种在水凝胶微柱内体外生成星形胶质细胞支架的方法

摘要

来源：Katiyar, K. S., 等. 三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生. J. Vis. Exp. (2018).

本视频展示了一种在水凝胶微柱内生成三维星形胶质细胞支架的方法。微柱内部涂有胶原蛋白，将星形胶质细胞引入后，细胞会黏附于胶原蛋白上，并在进一步培养过程中自组装形成三维支架。

方案

1. 琼脂糖水凝胶微柱的制备

1. 通过称取 3 g 琼脂糖并转移至含有 100 mL 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌烧杯中，配制 3% 质量/体积（w/v）的琼脂糖溶液。向烧杯中加入一个无菌磁力搅拌子，并将其置于加热搅拌器表面。在下一步操作中保持烧杯加盖，以防止内容物蒸发。
2. 在 100 °C 温度下加热琼脂糖与 DPBS 溶液，同时以 60–120 rpm 的速度搅拌。根据需要调整设置，并持续观察溶解过程的进展：溶液最初呈不透明状态，逐渐变为澄清，表明琼脂糖已完全溶解。
   注意：烧杯和溶液温度很高！
3. 在加热和搅拌琼脂糖溶液的同时，取出四个空的 10 cm 培养皿，并向其中两个加入 20 mL DPBS。将针灸针（直径：300 µm，长度：40 mm）、玻璃微量毛细管（直径：701.04 µm，长度：65 mm，容量：25.0 µL）以及橡胶吸头移液器放入生物安全柜中。当液态琼脂糖溶液变得澄清后，维持约 50 °C 的恒温加热并持续搅拌，以防止琼脂糖发生凝胶化。
4. 将一根针灸针插入橡胶吸头移液器底部的开口中。将一根毛细管套在暴露于外侧的针头上。通过将毛细管的一部分插入橡胶吸头移液器筒的橡胶部分，将其固定。
5. 用移液器将 1 mL 液态琼脂糖转移至一个空培养皿表面，将毛细管一端垂直插入琼脂糖中（针头已插入），同时向内挤压橡胶吸头移液器的胶帽。缓慢释放对胶帽的压力，将琼脂糖吸入毛细管内。
   注意：必须迅速完成将液态琼脂糖转移至毛细管中的操作。若液态琼脂糖在培养皿表面停留过久（约 60 秒），会开始凝胶化，从而阻碍琼脂糖在毛细管内的有效吸入。
6. 将每个吸头-毛细管-针头组件放入一个空的培养皿中，让毛细管内的琼脂糖凝胶固化 5 分钟。小心用手将毛细管从橡胶吸头移液器筒的橡胶塞中拔出，使针头和琼脂糖凝胶保留在毛细管内。
7. 手动缓慢地将针灸针从毛细管中抽出；在此过程中，新形成的琼脂糖柱也会随针一同滑出毛细管，仍包裹在针周围。用无菌镊子的尖端轻轻推动微柱沿针灸针移动至末端。将针置于盛有 DPBS 的开放培养皿上方，用镊子将微柱推入 DPBS 中。
   注意：若在取出针灸针时琼脂糖微柱仍滞留在玻璃毛细管内，可用 25 mm 规格的针头缓慢将琼脂糖微柱从毛细管中推出，并落入含 DPBS 的培养皿中。
8. 使用高温珠灭菌器对微型手术刀或镊子进行灭菌。通过称取 4 g 琼脂糖并转移至 100 mL DPBS 中，配制 4% w/v 琼脂糖溶液。按步骤 1.2 所述方法加热并搅拌，获得澄清的 4% 液态琼脂糖溶液。在后续步骤中持续加热并搅拌该溶液。
9. 将含有微柱的培养皿转移至解剖罩内，用精细镊子将一根微柱移至一个空培养皿中。利用体视显微镜进行视觉引导，并使用微型手术刀将微柱切割至所需长度。将两端修整成与水平方向呈 45^o 的斜面，以便在后续添加细胞外基质（ECM）和细胞时更易操作微柱。
10. 对同一培养皿中的其余三根微柱重复上述步骤，并将四个结构平行排列，各圆柱之间间距小于<3 mm。用移液器吸取 50 µL 4% 琼脂糖溶液，以细线状快速倾倒在微柱阵列上方，使结构连接并捆绑成每组四根的形式（此后称为“微柱船”）。为避免 4% 琼脂糖流入微柱末端造成堵塞，应尽量缩短结构间的距离，并以细线快速添加琼脂糖。
    注意：制作星形胶质细胞支架时，并非必须将四根微柱组合为“船”状结构。然而，此类“船”结构有助于加快制备过程，并在后续步骤中更安全地移动和操作微柱。
11. 让微柱船冷却 1–2 分钟，使所添加的 4% 琼脂糖完成凝胶化。用精细镊子夹住连接用的 4% 琼脂糖部分，将微柱船转移至步骤 1.1.3 中准备好的另一含 DPBS 的培养皿中。根据需要，用剩余微柱制备更多“船”结构。
12. 将含有微柱和/或微柱船的培养皿转移至生物安全柜中，暴露于紫外光（UV）下灭菌 30 分钟。
    注意：操作时应穿戴适当防护装备，避免紫外线暴露。
13. 若不立即进行 ECM 添加和细胞接种，可将含微柱船的培养皿在 4 °C 条件下保存于 DPBS 中，最长可保存 1 周。若在此期间未使用这些结构，需重新执行微柱制备步骤。

2. 原代细胞培养与分离

1. 从新生大鼠中分离皮质星形胶质细胞
   1. 为后续步骤做准备，将 20 mL 的 Hank 平衡盐溶液（HBSS）加入四个 10 cm 的培养皿中，作为解剖组织的储液槽。将所有培养皿置于冰上。使用热珠灭菌器对洁净的外科剪刀、镊子、微型刮匙和微型解剖刀进行灭菌。
   2. 在 37 °C 下预热含有 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.15 mg/mL 脱氧核糖核酸酶（DNase）I 的 0.25% 胰蛋白酶 HBSS 溶液。同时，将星形胶质细胞培养基在 37 °C 预热，该培养基由含 Ham's F-12 营养混合物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）和 10% 胎牛血清（FBS）组成。
   3. 通过低温暴露麻醉出生后第 0 天或第 1 天的 Sprague-Dawley 大鼠幼崽，并通过断头法实施安乐死。使用 19 mm 规格的针头插入眼睛前方的吻部，将头部固定在解剖台上。
   4. 使用解剖刀从颈部基部向前至眼睛后方沿中线做一纵向切口。再从眼睛正后方向下做一侧向切口，形成 T 形切口。用精细镊子将颅骨皮肤/颅骨向一侧掀开。
   5. 用镊子的一侧插入动物口中，另一侧置于外部表面，握住吻部（朝上）固定头部。用无菌微型刮匙取出脑组织，并将其放入盛有冷 HBSS 的培养皿中。操作间隙应立即将该培养皿放回冰上，仅在使用时取出。
   6. 将先前储存在 -20 °C 的花岗岩块置于解剖罩内的体视显微镜下方。将含有脑组织的培养皿放置在花岗岩块表面，以在解剖过程中保持低温。在接下来的步骤中始终使用体视显微镜作为视觉引导。
   7. 若嗅球仍完整，使用镊子或微型解剖刀将其切除。同时，使用微型解剖刀去除小脑，并沿中线切开以分离两个大脑半球。用镊子将半球转移至含有新鲜冷 HBSS 的培养皿中。
   8. 使用微型解剖刀从半球内部解剖中脑结构，仅保留分离的皮质组织。用精细镊子剥离皮质组织表面的膜状结构——软脑膜，并将分离的皮质组织转移至新的含冷 HBSS 的培养皿中。使用微型解剖刀将组织切碎，以增加下一步胰蛋白酶作用的表面积。
   9. 使用巴斯德移液管将皮质组织转移至含有 4 mL 预热胰蛋白酶-EDTA 溶液的 15 mL 离心管中（每管放入 8 个皮质组织）。在 37 °C 下孵育 5–7 分钟，使皮质组织暴露于胰蛋白酶-EDTA 中。
   10. 用巴斯德移液管小心吸除胰蛋白酶-EDTA 溶液，并向离心管中加入 400 µL 的 0.15 mg/mL DNase I 溶液。振荡或涡旋离心管，直至所有组织完全解离，液体中无残留组织碎片。若无法完全溶解组织，可用巴斯德移液管尖端移除剩余碎片。
   11. 将含有解离细胞悬液的离心管在 200 × g 条件下离心 3 分钟。用巴斯德移液管小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。使用微量移液器向管中加入 1 mL 星形胶质细胞培养基（见步骤 2.1.2），振荡混匀，使细胞重悬并形成均匀悬液。
   12. 使用刻度移液管向 T-75 培养瓶中加入 10 mL 星形胶质细胞培养基。使用微量移液器将 250 µL 的 1 mL 细胞悬液（步骤 2.1.11 制备）加入培养瓶中，每瓶接种相当于一只大鼠幼崽脑组织的细胞量。将细胞悬液均匀分布于培养基表面，并轻轻振荡培养瓶以促进细胞均匀分布。
   13. 将接种后的培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 的加湿培养箱中培养。在培养 24 小时和 72 小时后，机械振荡培养瓶以去除未贴壁的细胞类型，如神经元和少突胶质细胞。
   14. 随后，在每个时间点进行换液操作。将培养瓶垂直放置，使培养基位于瓶底，不覆盖贴壁细胞。用巴斯德移液管吸取培养基，将移液管尖端紧贴瓶底角落，以避免吸出细胞。将培养瓶恢复至水平位置后，使用刻度移液管轻轻加入 10 mL 星形胶质细胞培养基。
   15. 每次换液后将培养瓶放回培养箱。当细胞达到 90% 汇合度时，再次机械振荡培养瓶以去除任何残留的未贴壁细胞。
   16. 通过真空抽吸和巴斯德移液管移除培养基以传代星形胶质细胞。使用刻度移液管向贴壁细胞中加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。轻轻振荡培养瓶，确保胰蛋白酶覆盖所有细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5–7 分钟。
   17. 使用刻度移液管向细胞中加入 1 mL 星形胶质细胞培养基以终止胰蛋白酶反应。用刻度移液管将细胞悬液从培养瓶中转移至无菌 15 mL 离心管中。在 200 × g 条件下离心 3 分钟。
   18. 用刻度移液管吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 mL 星形胶质细胞培养基中。振荡混匀以确保细胞悬液均匀。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
       注意： 一个达到 90% 汇合度的培养瓶通常可获得约 300 万星形胶质细胞。
   19. 向 T-75 培养瓶中加入 10 mL 星形胶质细胞培养基。使用微量移液器将 250 µL 细胞悬液（步骤 2.1.18）转移至已含培养基的 T-75 培养瓶中，进行 1:4 稀释。轻轻振荡以确保细胞在整个培养瓶表面均匀分布。
   20. 每次达到 90% 汇合度时，重复步骤 2.1.16–2.1.19 进行细胞传代。
2. 从大鼠胚胎中分离皮质神经元
   1. ​参照步骤 2.1.1 和 2.1.2 进行类似准备，但预热的培养基为共培养基，其成分为 Neurobasal 培养基 + 2% B-27 添加剂（用于神经元）+ 1% G-5 无血清添加物（用于星形胶质细胞）+ 0.25% L-谷氨酰胺。
   2. 使用二氧化碳窒息法对妊娠第 18 天的 Sprague-Dawley 大鼠实施安乐死，并通过断头法确认死亡。
   3. 取出大鼠胚胎，在置于冷花岗岩块表面、含 HBSS 的培养皿中，使用体视显微镜作为视觉引导，配合灭菌剪刀、微型解剖刀和镊子，将皮质组织从其余脑组织中解剖分离。在依次完成头部、脑组织、大脑半球和皮质组织的解剖后，将每份组织转移至新的含 HBSS 的培养皿中。
   4. 将皮质组织切碎成更小的片段以增加胰蛋白酶作用的表面积。使用巴斯德移液管将 4–6 个皮质组织转移至含有 5 mL 预热胰蛋白酶-EDTA 溶液的离心管中，并在 37 °C 下孵育以解离组织。在 5–7 分钟时手动振荡离心管以混匀并防止组织结块。
   5. 10 分钟后将离心管从 37 °C 取出。如步骤 2.1 所述，吸除胰蛋白酶-EDTA 溶液，并替换为 1.8 mL 的 0.15 mg/mL DNase 溶液。随后涡旋组织悬液，直至溶液均匀，无组织碎片漂浮。
   6. 将解离后的组织悬液在 200 × g 条件下离心 3 分钟。吸除上清液后，用 2 mL 上述共培养基重悬细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。
      注意： 通常每侧皮质半球可获得 3.0–5.0 × 10⁶ 个细胞。
   7. 使用上述共培养基，将细胞悬液调整至密度为 2.0–4.0 × 10⁵ 个细胞/mL，制备新的细胞悬液。

3. 微柱内星形胶质细胞突起的发育

1. ECM 核心制备
   注意： 必须在进行细胞接种的当天，将 ECM 加入水凝胶微柱内部。
   1. 在生物安全柜内，用共培养培养基在无菌微量离心管中配制 1 mg/mL 的大鼠尾部 I 型胶原溶液。除使用时外，始终将含有 ECM 溶液的微量离心管置于冰上保存。
   2. 用移液器将 1–2 µL ECM 溶液转移至一条石蕊试纸上，以估计其 pH 值。用移液器加入 1 µL 1 N 氢氧化钠 (NaOH) 或盐酸 (HCl)，分别用于提高或降低 ECM 溶液的 pH 值，并反复吹打混匀。用石蕊试纸条检测新的 pH 值，并根据需要添加更多酸或碱，直至 pH 值稳定在 7.2–7.4 范围内。
   3. 将步骤 1.2 中的培养皿移至解剖罩内，用无菌精细镊子将 4–5 个微柱或一个支架转移至一个空的无菌 35 或 60 mm 培养皿中。在体视显微镜引导下，将移液器的 10 µL 吸头置于每个微柱的一端，吸出管腔内的 DPBS 和气泡。通过体视显微镜确认无气泡残留，以确保下一步加入的 ECM 能自由流经管腔。
   4. 用 P10 移液器吸取 ECM 溶液，将 10 µL 吸头紧贴水凝胶微柱的一端，注入足够溶液以填充管腔（约 3–5 µL），并在体视显微镜下观察 ECM 进入情况。在微柱两端各保留一小段 ECM 溶液储液（2–4 µL）。
      注意： 每次操作应仅处理 4–5 个微柱或一个支架，以防止结构长时间干燥，否则可能导致微柱结构塌陷。完全干燥的微柱会牢固粘附在培养皿表面，从而无法用于后续细胞接种。不能向微柱中添加过量共培养培养基（作为保湿措施），否则可能导致 ECM 在下述孵育期间流出。
   5. 在培养皿周围以环形方式加入共培养培养基，以提供湿度环境，防止微柱在孵育过程中干燥。将含有 ECM 的微柱置于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1 小时，以促进胶原聚合，之后再加入神经元和/或星形胶质细胞。
      注意： ECM 应在中空管腔内壁形成一层包被，而非填充整个内部的实心 ECM 核心，这两种状态均可通过体视显微镜观察。若 ECM 形成实心核心，应继续孵育直至仅剩内壁涂层。形成该涂层后，星形胶质细胞悬液可在后续铺板步骤中填充微柱内部。
   6. 在孵育期间，准备星形胶质细胞悬液（如下所述）。
2. 在微柱中接种星形胶质细胞和神经元
   1. 按步骤 2.1.16–2.1.19 所述方法传代培养的星形胶质细胞（第 4 至第 12 代）。计数培养瓶中的细胞数量后，用细胞培养基配制细胞悬液，浓度为 9.0–12.0 × 10⁵ 个细胞/mL。
   2. 在体视显微镜下，将 P10 移液器吸头置于微柱一端，注入足够细胞悬液（约 5 µL）以完全填充管腔。如同之前处理 ECM 一样，在每个微柱的两端各保留一小段细胞悬液储液。
   3. 将铺有微柱的培养皿置于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1 小时，以促进星形胶质细胞在 ECM 上的黏附。若不向微柱中添加神经元，则直接进入步骤 3.2.5。
   4. 初始孵育结束后，用移液器在体视显微镜下向微柱两端各加入 1–2 µL 步骤 2.2.7 所得的皮层神经元悬液。确保培养皿中有足够的培养基以防止干燥，并再次于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 40 分钟，以促进神经元黏附。
      注意： 皮层神经元悬液也可在束状结构形成后 1–2 天添加，此时需先用移液器小心吸出培养皿中的培养基，再执行步骤 3.2.4。
   5. 孵育结束后，小心地向含有微柱的培养皿中加入 3 或 6 mL 共培养培养基（分别对应 35 或 60 mm 培养皿）。将微柱继续在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养，以促进星形胶质细胞束的自组装，通常在 6–10 小时后形成束状、电缆样结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针灸针（300 µm 直径）	Lhasa Medical	HS.30x40	可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。
培养皿	Fisher	08772B
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Invitrogen	14200075
聚苯乙烯一次性移液管	Fisher	13-678-11D
琼脂糖	Sigma	A9539-50G
微升级玻璃毛细管（701 µm）	Fisher	21-170J	可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。
毛细管吸头吹打装置	Fisher	21-170J	吹打装置随毛细管配套提供。
加热板	Fisher	SP88857200
磁力搅拌子	Fisher	1451352
微量移液器	Sigma	Z683884-1EA
25 mm 规格针头	Fisher	14-826-49
微型手术刀	Roboz Surgical	RS-6270
剪刀	Fine Science Tools	14081-09
镊子	World Precision Instruments	501985
热珠灭菌器	Sigma	Z378550-1EA
体视显微镜	Nikon	SMZ800N
微型刮铲	Fisher	S50821
大鼠尾部 I 型胶原蛋白	Corning	354236	保持在 4 ºC 下，仅在需要时取出。使用时用冰保持其温度。
微量离心管	Fisher	02-681-256
氢氧化钠（NaOH）	Fisher	SS2661
盐酸（HCl）	Fisher	SA48-1
石蕊试纸	Fisher	09-876-18
亨克平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen	14170112	储存于 4 ºC。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I	Sigma	10104159001	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
含 Ham's F-12 营养混合物的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11330-032	储存于 4 ºC。
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11195	储存于 -20 ºC。
出生后第 0 天或第 1 天的 Sprague Dawley 大鼠幼崽	Charles River	Strain 001
Neurobasal 胚胎神经元基础培养基	Invitrogen	21103049	储存于 4 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
B-27 无血清添加剂	Invitrogen	12587010	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
L-谷氨酰胺	Invitrogen	35050061	储存于 -20 ºC，使用前在 37 ºC 预热。
G5 星形胶质细胞添加剂	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley 胚胎第 18 天大鼠	Charles River	Strain 001
巴斯德移液管	Fisher	22-042816
15 mL 离心管	EMESCO	1194-352099
涡旋振荡器	Fisher	02-215-414
离心机	Fisher	05-413-115
血细胞计数板	Fisher	02-671-6
培养箱	Fisher	13 998 076