开发一种基于工程化丝素蛋白-胶原的极化神经组织三维模型

摘要

来源：Chwalek, K. 等，基于丝素-胶原蛋白的极化神经组织工程化三维模型。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了利用丝素-胶原蛋白支架构建三维极化神经组织模型的过程。详细介绍了在多孔丝素支架上接种神经细胞、孵育以促进细胞贴附、用胶原蛋白包埋支架的操作步骤，并强调了支持性胶原基质在形成三维极化神经组织模型中的重要作用。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 蚕丝支架的制备

1. 从Bombyx mori蚕茧制备丝素溶液
   1. 用剪刀将每个蚕茧剪成8个相等的小块。准备约11个蚕茧，以获得5 g碎片状蚕茧。（15分钟）
   2. 配制2 L的0.02 M Na₂CO₃溶液，并用加热板煮沸。（15分钟）
   3. 称取5 g碎片状蚕茧，放入Na₂CO₃溶液中煮沸30分钟。每隔几分钟用刮刀搅拌一次。此步骤称为脱胶，用于从亲水性蛋白（丝胶蛋白）中纯化出丝素蛋白。（30分钟）
   4. 用手将丝素蛋白拧干，并用蒸馏水至少冲洗三次，以去除残留的丝胶蛋白和化学试剂。（5分钟）
   5. 将湿润的丝素蛋白置于培养皿中，并在通风橱内过夜干燥。
   6. 次日，称量干燥丝素蛋白的质量，并将其放入玻璃烧杯中。（15分钟）
   7. 为将丝素蛋白溶解于9.3 M LiBr溶液中，按每克干丝素蛋白需4 ml的比例计算所需LiBr体积（单位为ml）。缓慢将LiBr溶液倒入装有丝素蛋白的烧杯中，并用刮刀使所有丝素纤维完全浸没。盖上烧杯以防止蒸发，然后在60 °C下放置4小时，使纤维充分溶解。（15分钟）
   8. 使用注射器从烧杯中吸取丝素溶液，并将其转移至截留分子量为3,500的透析盒中。在蒸馏水中透析48小时，每隔几小时更换一次透析液。
   9. 使用注射器将透析后的丝素溶液从透析盒中吸出，转移至50 ml锥形管中，在4 °C下以9,000 rpm（约12,700 × g）离心20分钟，重复两次。每次离心后，将上清液倒入新的离心管中，弃去沉淀物。（40分钟）
   10. 通过测定干重估算丝素蛋白浓度。取1 ml丝素溶液加入称量舟中，在60 °C烘箱中干燥2小时。称量干燥后的丝素蛋白质量，并将该质量乘以100，计算出丝素蛋白溶液的浓度。预期丝素溶液浓度为6–9%（w/v）。
   11. 用蒸馏水稀释，将丝素蛋白浓度调整至6%（w/v）。
       ​暂停点：液态丝素蛋白可在密闭容器中于4 °C保存最多一个月。
2. 由丝素溶液制备多孔支架
   1. 将颗粒状NaCl过筛，分离出500–600 μm的颗粒，用于后续步骤。丢弃粒径小于500 μm或大于600 μm的颗粒。（15分钟）
   2. 将30 ml 6%丝素溶液倒入聚四氟乙烯（PTFE）模具中（图1）。均匀撒入60 g过筛后的NaCl颗粒。轻敲容器，使盐颗粒形成均匀层。在室温下孵育48小时，使丝素蛋白聚合。
   3. 将含有支架的PTFE模具放入60 °C烘箱中加热1小时，以完成聚合过程并蒸发残留液体。
   4. 将模具内容物放入盛有2 L蒸馏水的烧杯中浸泡48小时，以浸提出盐颗粒。每天换水2–3次。当盐完全浸出后，将海绵状支架从模具中取出。
      暂停点：海绵支架可浸没于水中，在4 °C密闭容器中保存，以防脱水。
   5. 使用直径5 mm的活检打孔器切割支架。预先切割支架，使其高度约为2 mm。再用直径2 mm的活检打孔器在支架中心打孔（图2A）。（1小时）
   6. 将支架浸没于水中进行高压灭菌，以实现消毒（湿热循环，121 °C，20分钟）。
      暂停点：海绵支架可浸没于水中，在4 °C密闭容器中保存，以防脱水。
   7. 在计划接种细胞前，将支架浸入无菌的0.1 mg/ml聚-D-赖氨酸（PDL）溶液中，在37 °C孵育1小时。
   8. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤支架3次，以去除未结合的PDL。（30分钟）

2. 大鼠皮层神经元的分离

1. 在获得批准的动物实验方案后，解剖胚胎第18天（E18）的Sprague-Dawley大鼠大脑皮层。（2小时）
2. 将10个皮层组织置于5 ml含0.25%胰蛋白酶和0.3% DNase I（来自牛胰腺）的溶液中，37 °C孵育20分钟。
3. 加入1 mg/ml大豆蛋白以灭活胰蛋白酶。
4. 使用10 ml巴斯德吸管轻轻吹打20次，使皮层组织充分解离成单细胞悬液。操作时应轻柔，避免产生气泡。（10分钟）
5. 将细胞悬液在127 × g条件下离心5分钟。
6. 将细胞沉淀重悬于10 ml培养基中（Neurobasal培养基，1× B27添加剂，1× Glutamax，1%青霉素/链霉素），计数细胞。预期细胞浓度约为2×10⁷/ml。（20分钟）

3. 构建体组装与培养

1. 细胞接种于支架
   1. 将无菌支架及所有所需器械移入细胞培养超净台内。使用无菌镊子将支架放入96孔细胞培养板中，每孔放置一个支架。（10 分钟）
   2. 用细胞培养基浸没支架，使其在接种细胞前达到平衡状态。于37 °C孵育1小时。（10 分钟）
   3. 吸除支架中多余的培养基。
   4. 每支架加入100 µl细胞悬液。（10 分钟）
   5. 将细胞于37 °C过夜孵育，以促进细胞在支架上的贴附。
   6. 次日早晨，吸除未贴附的细胞，并向每孔加入200 µl新鲜培养基。（10 分钟）
2. 支架包埋于胶原基质中。（2 小时）
   1. 将10× PBS、水、1 N NaOH和大鼠尾部I型胶原置于冰上。按照生产商说明书配制胶原工作液。在接种细胞的构建物准备就绪前（最长1小时），保持其处于冰上。
   2. 从培养箱中取出接种细胞的丝素蛋白构建物，并吸除多余培养基。
   3. 使用无菌镊子将支架转移至培养板中的空孔内，每孔加入100 µl 3 mg/ml胶原溶液浸没支架。将培养板放回培养箱孵育30分钟，以促进胶原聚合。
   4. 每孔加入100 µl预热的细胞培养基。将构建物培养一周，每天更换培养基，仅替换一半体积的培养基。

结果

图1. 用于制备丝素蛋白海绵支架的聚四氟乙烯（PTFE）模具。 尺寸：直径10 cm，高2 cm。

图2. 类脑三维组织模型。（A） 多孔丝素蛋白海绵支架。（B） 神经元接种于丝素蛋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
多聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	终浓度 10 μg/ml，溶于水
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	使用前预热至 37 °C
B27 添加剂（50 倍浓缩液）	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
青霉素-链霉素	Corning	30-002-CI
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾部来源，100 mg）	Corning	354236	终浓度 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	腐蚀性
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
截留分子量 3500 透析盒	Thermo Fisher	66110
加热板	Fisher Scientific	Isotemp
筛网	Fisher Scientific	No. 270、No. 35、No. 30
PTFE			自制模具（图 1），直径 10 cm，高 2 cm
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
5 mm 活检打孔器	World Precision Instrument	501909
2 mm 活检打孔器	World Precision Instrument	501908
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	终浓度 0.3%
大豆蛋白	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	终浓度 1 mg/ml