开发基于工程蚕丝胶原蛋白的极化神经组织 3D 模型

Abstract

来源:Chwalek， K. et al.， 工程的基于丝胶原的极化神经组织模型。J. Vis. Exp. （2015 年）。

该视频展示了利用丝胶原支架创建 3D 极化神经组织模型。它详细介绍了将神经元细胞接种在多孔丝支架上、孵育细胞附着、用胶原蛋白包埋支架的过程，并强调了支持性胶原蛋白基质在形成 3D 极化神经组织模型中的重要性。

Protocol

所有涉及样本采集的程序均已按照研究所的 IRB 指南执行。

1. 丝绸脚手架准备

1. 从家蚧中制备蚕丝溶液
   1. 用剪刀将每个茧切成 8 等份。使用 11 个茧对应 5 克碎裂的茧。（15 分钟）
   2. 准备 2 L 0.02 M Na₂CO₃ 溶液，用热板煮沸。（15 分钟）
   3. 称取 5 克碎茧，在 Na₂CO₃ 溶液中煮 30 分钟。用抹刀每隔几分钟搅拌沸腾的真丝。这一步称为脱胶，从亲水性蛋白丝胶中纯化丝素蛋白。（30 分钟）
   4. 用手拧干丝素蛋白，然后用蒸馏水冲洗至少 3 次，以洗掉残留的丝胶蛋白和化学物质。（5 分钟）
   5. 将湿的丝素蛋白放在培养皿上，并在通风橱 O/N 中干燥丝素蛋白提取物。
   6. 第二天，称取干燥的丝素蛋白块，并将丝素蛋白放入玻璃烧杯中。（15 分钟）
   7. 要将丝素蛋白溶解在 9.3 M LiBr 溶液中，通过将干丝素蛋白的质量乘以 4 来计算所需的 LiBr 体积（以 ml 为单位）。慢慢将 LiBr 溶液倒在丝素蛋白上，然后用抹刀浸入所有丝素蛋白纤维。盖上烧杯以防止蒸发，并将其置于 60 °C 下 4 小时，让纤维溶解。（15 分钟）
   8. 使用注射器从烧杯中收集丝素蛋白溶液，并将其装入 MWCO 3,500 透析盒中。用蒸馏水进行透析 48 小时。每隔几个小时换一次水。
   9. 使用注射器，将丝素蛋白溶液从盒中收集到50 ml锥形管中，并在4°C下以9,000 rpm（~12,700 x g ）离心两次，持续20分钟。每个离心步骤后，将上清液倒入新管中并弃去沉淀。（40 分钟）
   10. 通过估计干重来测量丝素蛋白的浓度。将 1 ml 真丝溶液倒入称量舟中。将样品放入 60 °C 的柱温箱中干燥 2 小时。称量干丝素蛋白，并将获得的重量乘以 100 来计算丝素蛋白溶液的浓度。蚕丝溶液的预期浓度为 6-9% （w/v）。
   11. 通过在蒸馏水中稀释将真丝浓度调整为 6% （w/v><）。 终止点:液体丝素蛋白可在 4 °C 下在密闭容器中储存长达一个月。
2. 从丝溶液制备多孔支架。
   1. 筛分颗粒 NaCl 以分离 500-600 μm 颗粒，这将在后续步骤中使用。丢弃尺寸低于 500 μm 和 600 μm 以上的颗粒。（15 分钟）
   2. 将 30 ml 6% 丝溶液倒入聚四氟乙烯 （PTFE） 模具中（图 1）。将 60 克过筛的 NaCl 轻轻撒在真丝上。轻敲容器以获得均匀的盐层。在 RT 下孵育 48 小时以聚合真丝。
   3. 将含有支架的 PTFE 模具放入 60 °C 的烘箱中 1 小时，以完成聚合并蒸发任何剩余的液体。
   4. 将 PTFE 模具的内容物放入装有 2 L 蒸馏水的烧杯中 48 小时，以浸出盐。每天换水 2-3 次。当盐完全浸出时，从模具中取出海绵支架。
      停止点:海绵可以浸入 4 °C 的水中，放在密闭容器中，以防止支架脱水。
   5. 准备好后，用直径为 5 mm 的活检打孔器切出支架。预先切割脚手架，使其达到约 2 毫米的高度。用直径为 2 mm 的活检打孔器打出支架的中心（图 2A）。（1 小时）
   将
   6. 浸入水中的支架高压灭菌以对其进行消毒（湿循环，121 °C，20 分钟><）。 停止点:海绵可以浸入 4 °C 的水中，放在密闭容器中，以防止支架脱水。
   7. 在计划的细胞接种之前，将支架浸入无菌的 0.1 mg/ml 聚-D-赖氨酸 （PDL） 溶液中。在 37 °C 下孵育 1 小时。
   8. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤支架 3 次，以去除未结合的 PDL。（30 分钟）

2. 大鼠皮层神经元的分离

1. 在获得批准的动物方案后，解剖胚胎第 18 天 （E18） Sprague-Dawley 大鼠的皮层。（2 小时）
2. 将 10 个皮质在 5 ml 0.25% 胰蛋白酶和 0.3% DNase I（来自牛胰腺）中于 37 °C 孵育 20 分钟。
3. 通过添加 1 mg/ml 大豆蛋白来灭活胰蛋白酶。
4. 使用 10 ml 巴斯德移液管上下吹打 20 次，研磨皮质，直至产生单细胞悬液。要轻柔，避免形成气泡。（10 分钟）
5. 将细胞悬液以 127 x g 离心 5 分钟。
将
6. 细胞沉淀重悬于 10 ml 培养基（Neurobasal 培养基、1x B27 补充剂、1x Glutamax、1% 青霉素/链霉素）中。计数细胞。预期细胞浓度约为 2x10⁷/ml（20 分钟）

3. 构建集会和文化

1. 细胞支架接种
   1. 将无菌支架和所有必需的器具移至细胞培养罩内。使用无菌镊子将支架放入 96 孔细胞培养板中，每孔分配一个支架。（10 分钟）
   在
   2. 细胞接种前，将支架浸入细胞培养基中以平衡它们。在 37 °C 下孵育 1 小时（10 分钟）
   3. 从支架中吸出多余的培养基。
   4. 应用 100 μl 细胞悬液/支架。（10 分钟）
   5. 在 37 °C O / N 下孵育细胞，以允许细胞附着在支架上。
   6. 第二天早上，吸出未贴壁的细胞并应用 200 μl/孔的新鲜培养基。（10 分钟）
2. 胶原蛋白基质的支架包埋。（2 小时）
   1. 将 10 x PBS、水、1 N NaOH 和大鼠尾 I 胶原蛋白置于冰上。按照制造商的说明准备胶原蛋白的工作溶液。在冰上保持，直到细胞接种的构建体准备好（最多 1 小时）。
   2. 从培养箱中取出细胞接种的丝构建体，并吸出多余的培养基。
   3. 使用无菌镊子将支架转移到孔板上的空孔中，并将每个支架浸入 100 μl 3 mg/ml 胶原蛋白溶液中。将组织培养板放回培养箱中 30 分钟，以允许胶原蛋白聚合。
   4. 应用 100 μl 预热的细胞培养基/孔。将构建体培养一周，每天更换培养基，仅更换培养基体积的一半。

Results

图 1.聚四氟乙烯模具用于蚕丝海绵脚手架的制备。尺寸:直径 10 厘米，高 2 厘米。

图 2. 3D 类脑组织模型。（A） 多孔蚕丝海绵脚手架。 （B） 在胶原包埋前接种到丝架上后第 1 天的神经元活/死染色（绿色活细胞、红色死细胞）。右侧的面板显示了以红框捕获的区域的放大倍数。

Materials