开发一种基于工程化丝素蛋白-胶原的极化神经组织三维模型

摘要

来源：Chwalek, K. 等，基于丝素-胶原蛋白的极化神经组织工程化三维模型。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了利用丝素-胶原蛋白支架构建三维极化神经组织模型的过程。详细介绍了在多孔丝素支架上接种神经细胞、孵育以促进细胞贴附、用胶原蛋白包埋支架的操作步骤，并强调了支持性胶原基质在形成三维极化神经组织模型中的重要作用。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 蚕丝支架的制备

1. 从Bombyx mori蚕茧制备丝素溶液
   1. 用剪刀将每个蚕茧剪成8个相等的小块。准备约11个蚕茧，以获得5 g碎片状蚕茧。（15分钟）
   2. 配制2 L的0.02 M Na₂CO₃溶液，并用加热板煮沸。（15分钟）
   3. 称取5 g碎片状蚕茧，放入Na₂CO₃溶液中煮沸30分钟。每隔几分钟用刮刀搅拌一次。此步骤称为脱胶，用于从亲水性蛋白（丝胶蛋白）中纯化出丝素蛋白。（30分钟）
   4. 用手将丝素蛋白拧干，并用蒸馏水至少冲洗三次，以去除残留的丝胶蛋白和化学试剂。（5分钟）
   5. 将湿润的丝素蛋白置于培养皿中，并在通风橱内过夜干燥。
   6. 次日，称量干燥丝素蛋白的质量，并将其放入玻璃烧杯中。（15分钟）
   7. 为将丝素蛋白溶解于9.3 M LiBr溶液中，按每克干丝素蛋白需4 ml的比例计算所需LiBr体积（单位为ml）。缓慢将LiBr溶液倒入装有丝素蛋白的烧杯中，并用刮刀使所有丝素纤维完全浸没。盖上烧杯以防止蒸发，然后在60 °C下放置4小时，使纤维充分溶解。（15分钟）
   8. 使用注射器从烧杯中吸取丝素溶液，....

结果

图1. 用于制备丝素蛋白海绵支架的聚四氟乙烯（PTFE）模具。 尺寸：直径10 cm，高2 cm。

图2. 类脑三维组织模型。（A） 多孔丝素蛋白海绵支架。（B） 神经元接种于丝素蛋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
多聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	终浓度 10 μg/ml，溶于水
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	使用前预热至 37 °C
B27 添加剂（50 倍浓缩液）	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
青霉素-链霉素	Corning	30-002-CI
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾部来源，100 mg）	Corning	354236	终浓度 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	腐蚀性
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
截留分子量 3500 透析盒	Thermo Fisher	66110
加热板	Fisher Scientific	Isotemp
筛网	Fisher Scientific	No. 270、No. 35、No. 30
PTFE			自制模具（图 1），直径 10 cm，高 2 cm
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
5 mm 活检打孔器	World Precision Instrument	501909
2 mm 活检打孔器	World Precision Instrument	501908
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	终浓度 0.3%
大豆蛋白	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	终浓度 1 mg/ml