人多能干细胞来源的分化神经元的重铺板

摘要

来源：Calabrese, B. 等，人多能干细胞来源神经元的分化后重铺板用于神经突形成和突触成熟的高内涵筛选。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了一种利用温和蛋白水解酶分离并重新接种人多能干细胞来源神经元的方法。经过滤和离心后，将神经元重新接种于包被的多孔板中进行孵育，以促进其贴壁和成熟。

方案

1. 传代前的分化阶段

1. 使用选定的方案在10 cm培养皿中进行神经元分化，直至神经元形成密集的突起网络，并不仅表达MAP2或TuJ1等早期神经元标志物，还表达NeuN等晚期标志物。
2. 在神经元分化过程中，每4天更换一半选定的培养基。
   注意：更大量或更频繁的换液会稀释关键的神经营养因子，可能不利于神经元成熟。
   1. 对于iPSC来源的WT126神经元，使用以下分化后培养基：在500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）中加入5 mL 100倍N2（神经）添加剂、10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、10 ng/mL胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）、1 µg/mL层粘连蛋白、200 µM抗坏血酸、1 µM二丁酰-cAMP以及10 mL SM1。通过半量换液逐步替换为神经基础培养基（材料表）及相同的添加剂。
   2. 对于诱导多能干细胞或iPSC来源的CVB WT神经元，使用以下分化后培养基：500 mL神经基础A培养基（材料表）与500 mL DMEM/F12培养基混合，其中包含2 µg/mL层粘连蛋白、10 mL谷氨酰胺添加剂（材料表）、0.75 mg/mL碳酸氢钠、5 mL最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、0.2 mM抗坏血酸、10 ng/mL BDNF、20 mL 50倍B27添加剂和10 mL 100倍N2添加剂。

2. 多孔板包被

1. 传代前一天，用多聚-L-鸟氨酸（PLO）包被。将PLO溶于无菌水中，配制成储存液（10 mg/mL），于-20 °C保存。使用时将PLO按1:100比例稀释于水中，用于包被玻璃表面时终浓度为50 µg/mL，包被塑料表面时按1:1,000比例稀释（10 µg/mL）。
2. 将包被液直接加入目标培养板中，根据培养板规格使用适当的包被体积（例如，24孔板每孔加入500 µL PLO溶液）。
3. 室温避光孵育过夜。
4. 传代当天取出已包被的培养板，转移至无菌生物安全柜中。
5. 吸除PLO溶液，并用无菌水冲洗两次。
6. 将层粘连蛋白（laminin，1.15 mg/mL）用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:400比例稀释。
   注意：在4 °C条件下解冻层粘连蛋白，并迅速加入PBS中，以避免蛋白聚集和包被不均。
7. 吸除无菌水，向先前已用PLO包被的孔中每孔加入500 µL层粘连蛋白包被液。
8. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育至少4–6小时；对于玻璃表面，可延长孵育时间至16小时。应保持孵育时间一致。

3. 重新接种分化神经元

1. 用 PBS 轻柔地冲洗一次分化神经元培养板。将 PBS 沿着培养板壁轻柔加入，避免直接加到细胞上，以防破坏细胞。
2. 轻柔吸除 PBS，注意避免直接接触细胞，应在倾斜培养皿朝向操作者的一侧时从边缘吸液。
3. 每 10 cm 培养板加入至少 1 mL 蛋白酶溶液（材料表），然后将细胞放回培养箱。若组织培养室因湿度较低导致蒸发较快，可适当增加加入体积。
4. 在 37 °C 下用蛋白酶孵育细胞 40–45 分钟，以使细胞从培养板上脱落，并从神经网络中分离。
   注意：此步骤的时间控制至关重要。过早终止蛋白酶反应可能导致传代后细胞死亡率升高。蛋白酶生产商建议，在较低温度（如 4 °C）下延长孵育时间（例如过夜）可用于细胞系传代。然而，应避免在 4 °C 下处理神经元，因为低温暴露后神经元存活率通常较差。生产商还指出，在 37 °C 下孵育 60 分钟会导致该酶的酶活性失活。但根据作者经验，在 37 °C 下孵育 40–45 分钟足以实现人诱导多能干细胞来源神经元培养物的有效解离，并在传代后获得良好的神经元存活率。
5. 在孵育过程中使用相差显微镜观察神经元，继续蛋白酶处理，直至神经网络完全从培养板脱离，并在显微镜下轻微晃动培养板时开始分裂成较小的片状结构。
6. 每 1 mL 蛋白酶使用 5 mL 新鲜 DMEM 培养基终止消化反应。使用移液管轻柔吹打细胞 5–8 次以打散神经网络。吹打时注意不要施加过大压力，因为分化后的神经元较为脆弱。请勿使用 P1000 吸头，因其末端过于尖锐狭窄，可能剪切或损伤神经元。
7. 将含细胞的溶液逐滴通过孔径为 100 µm 的细胞筛网过滤至新的 50 mL 圆底离心管中。
8. 待细胞完全滤过后，用额外 5 mL 新鲜 DMEM 培养基冲洗筛网。
9. 在台式离心机中以 1,000 × g 离心 5 分钟。
10. 将离心管放回生物安全柜中，吸除大部分上清液，保留约 250 µL 以确保细胞保持湿润。
11. 用 2 mL 新鲜 DMEM 培养基轻柔重悬细胞。不要用移液器将细胞沉淀吹打至管壁。建议轻柔倒置离心管 2–3 次，并将细胞通过 5 mL 移液管末端轻轻吹打以充分悬浮细胞。
12. 取 10 µL 重悬的神经元溶液加至血细胞计数板边缘。
13. 在此重悬步骤中，向细胞液滴中加入 8–10 µL 台盼蓝溶液以评估细胞活力。取 10 µL 混合液加入血细胞计数板或其他自动细胞计数仪中。将呈相位明亮且排斥台盼蓝染料的细胞判定为活细胞。
14. 计算每毫升活细胞数量，并根据所需细胞密度准备稀释离心管中的细胞悬液。
15. 384 孔板每孔接种约 10,000 个细胞；24 孔板每孔接种约 150,000–200,000 个细胞。
16. 向重悬细胞的离心管中加入新鲜 DMEM 培养基以达到适当稀释倍数，并根据特定细胞系的需求添加适当的补充物，如 B27 和/或 BDNF。
17. 轻柔倾斜离心管混合 2–3 次。
18. 使用 16 道移液器吸除 24 孔板或 384 孔多孔板中的层粘连蛋白包被液，并用 PBS 冲洗一次。
19. 使用 P1000 移液器吸除 24 孔板中的 PBS，或使用 16 道移液器吸除 384 孔板中的 PBS。
20. 以“8”字形方式将细胞悬液加入各孔，以避免细胞聚集。也可使用自动化液体处理设备优化接种均匀性。
    注意：传代后 2–4 天开始在培养基中添加层粘连蛋白，有助于维持细胞的均匀分布。
21. 对每个孔重复步骤 3.19 和 3.20。
22. 将培养板放回设定为 37 °C 和 5% 二氧化碳的培养箱中。
23. 2 天后，开始每隔 4 天更换一半培养基，使用第 1.2 节所述的分化后培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-抗坏血酸	Sigma	A4403	向1L N2B27培养基中加入1ml 200mM储备液
二丁酰-cAMP	Sigma	D0627	添加至终浓度1 µM
人BDNF	Peprotech	450-02	终浓度为10 ng/ml
B27 (50X)	Thermofisher Scientific	17504044	向1L N2B27培养基中加入20 ml
含Glutamax的DMEM/F12	Thermofisher Scientific	31331093	加入N2，分装至50 mL离心管中；用封口膜包裹瓶盖
人GDNF	Peprotech	450-10	终浓度为10 ng/ml
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	向1L N2B27培养基中加入10 ml；作为谷氨酰胺补充剂
小鼠层粘连蛋白	Sigma	P3655-10mg	向50 mL N2B27中加入100 µl
MEM非必需氨基酸	Thermofisher Scientific	11140035	向1L N2B27培养基中加入5ml
N2 (100X) 补充剂	Life Technologies	17502048	向500mL培养基中加入5ml
Neurobasal A 培养基	Thermofisher Scientific	10888022	与DMEM/F12混合配制N2B27培养基，用于CVB wt细胞；神经基础A培养基
Neurobasal 培养基	Thermofisher Scientific	21103049	用于WT126细胞；神经基础培养基
SM1 补充剂	StemCell Technologies	5711	按1:50比例加入培养基
碳酸氢钠	Thermofisher Scientific	25080-094	向1L N2B27培养基中加入10ml
培养板制备
10cm 组织培养皿	Fisher Scientific	08772-E	塑料材质，经组织培养处理
6孔组织培养皿	Thomas Scientific	1194Y80	NEST品牌培养板
小鼠层粘连蛋白	Life Technologies	23017-015	以1:400比例包被塑料表面
多聚鸟氨酸	v	P3655-10mg	以1:1000比例包被塑料表面
超纯去离子水	Life Technologies	10977-015	用于稀释多聚-L-鸟氨酸
重铺板试剂
100mM 细胞筛网	Corning	431752	无菌，独立包装
未包被384孔板	PerkinElmer	6007550	需用PLO和层粘连蛋白进行包被
DPBS	Life Technologies	14190144	杜氏磷酸盐缓冲液
多聚-D-赖氨酸预包被384孔板	PerkinElmer	6057500	包被层粘连蛋白前需先冲洗