重新接种来自人多能干细胞的分化神经元

摘要

来源:Calabrese， B. et al.， 人类多能干细胞衍生神经元的分化后重新电镀用于新生发生和突触成熟的高内涵筛选。J. Vis. Exp. （2019 年）

该视频展示了一种使用温和的蛋白水解酶分离和再植入人类多能干细胞衍生神经元的方法。过滤和离心后，将神经元重新接种在包被的多孔板上进行孵育，促进附着和成熟。

方案

1. 重新电镀前的分化期

1. 使用选择的方案在 10 cm 培养皿上分化神经元，直到神经元与其过程形成一个厚网络，并且不仅表达早期神经元标志物（如 MAP2 或 TuJ1），还表达晚期标志物（如 NeuN）。
2. 在神经元分化过程中每 4 天更换一半所选培养基。
   注意: 更广泛或更频繁的培养基变化会稀释必需的营养因子aq，并可能不利于成熟。
   1. 对于 iPSC 衍生的 WT126 神经元，使用以下分化后培养培养基:5 mL 100x N2（神经）补充剂、10 ng/mL 脑源性神经营养因子 （BDNF）、10 ng/mL 神经胶质细胞系源性神经营养因子 （GDNF）、1 μg/mL 层粘连蛋白、200 μM 抗坏血酸、1 μM 二丁酰基-cAMP 和 10 mL SM1，用于 500 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12）。逐渐地，使用半培养基更换，用神经基础培养基（材料表）和相同的补充剂替换。
   2. 对于诱导多能干细胞或 iPSC 衍生的 CVB WT 神经元，使用以下分化后培养基:500 mL 神经基础 A 培养基（材料表）和 500 mL DMEM/F12 培养基，含 2 μg/mL 层粘连蛋白、10 mL 谷氨酰胺补充剂（材料表）、0.75 mg/mL 碳酸氢钠、5 mL 最低必需培养基 （MEM） 非必需氨基酸， 0.2 mM 抗坏血酸、10 ng/mL BDNF、20 mL 50x B27 和 10 mL 100x N2 添加剂。

2. 包被多孔

1. 重新电镀前一天，涂上聚-L-鸟氨酸 （PLO）。将 PLO 溶于无菌水中，制成储备液 （10 mg/mL）。将此储备液储存在 -20 °C。用水稀释 PLO 1:100，镀膜玻璃时产生 50 μg/mL 的浓度，涂覆塑料时产生 1:1,000 的比率 （10 μg/mL）。
2. 将涂层直接涂在目标板上。使用适合板尺寸的涂层体积（即，对于 24 孔板，每孔应用 500 μL PLO 溶液）。
3. 让板在室温下避光放置过夜。
4. 在重新电镀当天取回涂层板并转移到无菌生物安全柜中。
5. 吸出 PLO 溶液并用无菌水冲洗两次。
6. 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以 1:400 稀释度稀释层粘连蛋白 （1.15 mg/mL><）。 注意: 在 4 °C 下解冻层粘连蛋白并快速添加到 PBS 中，以避免层粘连蛋白聚集和涂层不均匀。
7. 吸出无菌水，并将 500 μL 层粘连蛋白涂层涂在先前涂有 PLO 的孔中。
8. 将板置于 37 °C 培养箱中至少 4-6 小时。对于玻璃表面，使用更长的孵育时间，最长可达 16 小时。使用一致的孵育时间。

3. 重新电镀分化的神经元

1. 用 PBS 轻轻冲洗分化神经元板一次。将 PBS 轻轻地沿着板壁分散，而不是直接分散到细胞上，以避免破坏它们。
2. 轻轻吸出 PBS，注意避免直接接触细胞，但要从培养皿边缘吸出，同时将其倾斜到研究人员。
3. 每 10 cm 板至少使用 1 mL 蛋白水解酶（材料表），并将细胞放回培养箱中。如果组织培养室由于低湿度而表现出高蒸发速率，则添加体积略高。
4. 将细胞与蛋白水解酶孵育 40-45 分钟，以便将它们从板中分离出来，并与神经元网络中的其他神经元分离><。 注意: 此步骤的时机至关重要。过早淬灭蛋白酶会导致重新铺板后细胞死亡增加。蛋白水解酶制造商建议使用远低于 37 °C 的温度，并延长传代细胞系的孵育时间（例如，在 4 °C 下过夜）。然而，应避免在 4 °C 下处理神经元，因为它们在寒冷暴露后通常表现出较差的存活率。制造商还指出，在 60 °C 下与酶孵育 37 分钟会导致其酶失活。然而，根据作者的经验，在 37 °C 下孵育 hiPSC 衍生的神经元培养物 40-45 分钟足以在重新接种时实现有效解离和出色的神经元存活。
5. 在孵育期间在相差显微镜上检查神经元，并允许蛋白酶处理继续，直到神经网络完全从板上分离，并在显微镜下短暂摇动板后开始分裂成更小的片状。
6. 在 10 cm 板中使用每 1 mL 蛋白酶 5 mL 新鲜 DMEM 培养基淬灭蛋白酶活性，以停止消化。使用血清移液器将细胞轻轻研磨板 5-8 次以破坏网络。研磨时要小心不要施加太大的压力，因为分化的神经元很脆弱。不要使用 P1000 尖端，因为末端太尖太窄，因此会使神经元变得陡峭或损坏。
7. 通过直径为 100 μm 网孔的细胞过滤器将含有细胞的溶液逐滴滴入新的 50 mL 锥形管中。
8. 细胞过滤后，再用 5 mL 新鲜 DMEM 培养基冲洗过滤器。
9. 在台式离心机中以 1,000 x g 离心细胞 5 分钟。
10. 将锥形管放回生物安全柜中，吸出大部分培养基，留下约 250 μL 以确保细胞保持水分。
11. 在 2 mL 新鲜 DMEM 培养基中轻轻重悬细胞。不要将沉淀移液到试管的侧面。相反，轻轻倒置锥形管 2-3 次，然后让细胞通过 5 mL 血清移液管的末端以将其移出。
12. 将 10 μL 重悬的神经元涂在血细胞计数器的边缘。
13. 向细胞液滴中加入 8-10 μL 台盼蓝，以评估此重悬步骤中的细胞活力。将 10 μL 这种混合物加入血细胞计数器或其他自动细胞计数仪中。评估那些相位明亮并排除台盼蓝染料的细胞为活力。
14. 确定活细胞的量/mL，并准备根据所需的细胞密度稀释锥形管的内容物。
15. 对于 384 孔板，每孔板接种 ~10,000 个细胞;对于 24 孔板，每孔接种 ~150,000-200,000 个细胞。
16. 将新鲜的 DMEM 添加到重悬细胞的锥形管中，以达到适当的稀释，并根据特定细胞系的要求添加其他适当的补充剂，例如 B27 和/或 BDNF。
17. 轻轻倾斜锥形管混合 2-3 次。
18. 使用 16 通道移液管从 24 孔板或 384 孔多孔板中吸出层粘连蛋白涂层，并用 PBS 冲洗一次。
19. 使用 P1000 吸出 PBS（用于 24 孔板）或 16 通道移液器（用于 384 孔板）。
20. 以 8 字形运动将细胞溶液涂抹到每个孔中，以避免结块。使用自动液体处理设备也可以优化电镀均匀性。
    注意: 重新接种后 2-4 天开始向培养基中添加层粘连蛋白也有助于维持细胞的均匀分布。
21. 对每个孔重复步骤 3.19 和 3.20
。
22. 将板放回培养箱中，设置为 37 °C 和 5% 二氧化碳。
23. 2 天后，使用第 1.2 节中描述的分化后培养培养基开始每 4 天更换一半的培养基。

材料