使用微流控芯片开发人类 iPSC 衍生的运动神经类器官

摘要

来源:Osaki， T. 等人 三维运动神经类器官生成。J. Vis. Exp. （2020）。

该视频演示了创建运动神经类器官的方法，首先在特殊培养基中培养人诱导的多能干细胞以形成球状体，然后使用特异性抑制剂将它们分化为运动神经元，最后在微流体芯片中培养它们以延长轴突并形成运动神经类器官。

方案

1. 通过光刻技术制造 SU-8 模具

注意:此程序涉及危险化学品。全程使用通风柜和个人防护装备。

1. 用丙酮清洁硅晶片（直径 4 英寸，厚度 1 毫米，抛光），然后用氮气吹气。然后在 180 °C 下烘烤 3 分钟至干燥。
2. 将 3 mL SU-8 2100 分配到清洁的晶圆上。
3. 使用旋涂机以 500 rpm 的速度将 SU-8 均匀地涂布在晶圆上 10 s，然后以 1500 rpm 的加速度依次旋转 30 s，加速度为 300 rpm/s，以获得 150 μm 厚的 SU-8.
   层 注意:确保硅晶片位于旋涂机的中心，并通过真空正确固定。
4. 将晶圆在热板上软烤 50 °C 10 分钟，在 65 °C 下软烤 7 分钟，在 95 °C 下软烤 45 分钟。
5. 将光掩模（图 1）设置到掩模对准器上，并将紫外光 （365 nm） 曝光 60 s.
   注意:需要通过适当剂量的紫外线来优化曝光时间。
6. 曝光后，将晶圆在 65 °C 下烘烤 6 分钟，然后在 95 °C 下在热板上烘烤 13 分钟。
7. 使用 Orbital Shaker 在 SU-8 显影剂中搅拌晶片 10-20 分钟，在此过程中更换一次显影溶液><。 注意:延长 SU-8 碎片残留的显影时间。
8. 用异丙醇冲洗晶片，然后用氮气轻轻干燥晶片。
9. 通过测量显微镜测量沉积的 SU-8 的高度，并确保其厚度约为 150 μm。它可以在室温下无限期保存。

2. 基于聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 的微流控组织培养芯片制造

1. 通过双面胶带将 SU-8 沉积的晶片固定在容器（例如，15 cm 塑料培养皿）上。
2. 使用氮气吹掉晶圆上的灰尘。
3. 为了硅化，将 SU-8 沉积的晶圆与一个小容器（例如，35 毫米培养皿）一起放入真空室中。将 10 μL （十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）-1-三氯氢硅烷滴入小容器中。不要将 （tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl）-1-trichlorosilane 直接涂覆到 SU-8 晶片上。
4. 关闭真空室并打开真空泵至少 2 小时。
5. 取一个塑料杯，以 10:1 的重量比倒入有机硅弹性体（例如 Silpot 184 或同等产品 Sylgard 184）和固化剂。然后，使用刮刀充分混合，并在真空室中脱气，直到气泡完全去除。
6. 将 PDMS 混合物倒入装有 SU-8 晶片的容器中，直至所需厚度 （3-4 mm），然后再次脱气以去除气泡。
将
7. PDMS 放入 60 °C 的烘箱中烘烤至少 3 小时，以完全固化 PDMS。
8. 冷却后，使用手术刀或剃须刀片从晶圆上切下固化的 PDMS。
9. 要创建组织培养芯片的两个腔室，请使用直径为 1.5 mm 的活检打孔器在两个隔室所在的位置打两个孔。
10. 为了创建一个培养基储液器，准备另一种 PDMS 混合物（有机硅弹性体和固化剂的重量比为 10:1），并将其倒入一个新的 10 cm 培养皿中。将倾倒量调整为 PDMS 的厚度为 5 mm。
将
11. PDMS 放入 60 °C 的烘箱中烘烤至少 3 小时，以完全固化 PDMS。
12. 冷却 PDMS 后，用手术刀切下固化的 PDMS，得到一个矩形环。
13. 通过在底层之间应用未固化的 PDMS 并烘烤组装的 PDMS 层，将底层与培养基储液器粘合。这种键合结构产生了 PDMS 组织培养芯片。
14. 用透明胶带清洁 PDMS 组织培养芯片，以去除表面的灰尘和小颗粒。PDMS 组织培养芯片可以在室温下储存，前提是避免灰尘和紫外线。

3. 培养物的准备

1. 培养基
   注意:除非另有说明，否则下面列出的所有培养基都应进行过滤以进行灭菌。制备的培养基可在 4 °C 下储存并在一个月内使用。
   1. 制备 mTeSR Plus 培养基:将一瓶 100 mL mTeSR Plus 5x 添加剂与一瓶 400 mL mTeSR Plus 基础培养基混合。
   2. 制备 100 mL KSR 培养基:在 85 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基或 DMEM/F12 中，加入 15 mL 基因敲除血清替代物（KSR，15%）、1 mL 市售谷氨酰胺补充剂 （1%） 和 1 mL 非必需氨基酸（NEAA，1%）。
   3. 制备 100 mL N2 培养基:在 100 mL Neurobasal 培养基中，加入 1 mL N2 （100x）、1 mL 市售谷氨酰胺添加剂和 1 mL NEAA。
   4. 制备 250 mL 成熟培养基:在 250 mL Neurobasal 培养基中，加入 5 mL B27 （2%）、2.5 mL 市售谷氨酰胺补充剂 （1%） 和 2.5 mL 青霉素/链霉素 （1%）。
   5. 将化合物（视黄酸 （RA）、SB431542、LDN-193189、SU5402、DAPT、SAG、Y-27632）重悬于细胞培养级 DMSO 中至所需浓度。准备等分试样并将其在 -20 °C 下储存长达 6 个月。使用以下储备溶液:1 mM RA、10 mM SB431542、100 μM LDN-193189、10 mM SU5402、10 mM DAPT、1 mM SAG、10 mM Y-27632。
2. 涂层
   注意: 为防止基底膜基质因热量而聚合，请避免重复冻融循环。如果可能，使用预冷的移液器吸头和试管处理所有涂层程序。基底膜基质应在 4 °C 下解冻过夜，并使用预冷的移液器吸头和试管等分。等分试样可在 -20 °C 或 -80 °C 下冷冻。
   1. 在 4°C 的冰上解冻冷冻等分试样。在涂层过程中，等分试样应保持低温。使用预冷的移液器吸头，用冰冷的 DMEM/F12 以 1:40 的比例稀释基底膜基质。如果未发生聚合，未使用的稀释基底膜基质可以在 4 °C 下储存 2-3 天。
   2. 加入 1 mL 基底膜基质/DMEM-F12 溶液，以包被 6 孔板的一个孔。
   3. 将板在室温下孵育至少一小时，或在 4 °C 下孵育过夜。包被板可在 4 °C 下储存最多一周。

4. iPS 细胞的维持

1. 如前所述在步骤 3.2 中提到的准备基底膜基质包被的培养皿。
2. 完全吸出 mTeSR Plus 培养基。用 PBS 洗涤孔一次，并加入 0.5 mL 传代试剂（参见材料表）。等待几秒钟并吸出溶液。
3. 将板在 37 °C 下在培养箱中孵育 5 分钟或直到细胞变成圆形><。 注意: 孵育时间可能因不同的 iPS 细胞系和汇合度而异。请在显微镜下定期检查以确定孵育过程中的解离时间。
4. 加入 1 mL mTeSR Plus 培养基，敲击板 30-60 秒以分离菌落。
5. 将 1 mL 细胞悬液与 7 mL 新鲜 mTeSR 加培养基轻轻混合。移液不要超过 5 次。
6. 以 1:8 的比例板。通常添加 1 mL 步骤 5.5 中的悬浮液，并添加 1 mL mTeSR 加补充有 5-10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂）的培养基。传代稀释率取决于 iPSC 细胞系。
7. 将细胞置于 5% CO 2 / 37 °C 培养箱中。第二天，通过添加新鲜的 mTeSR Plus 培养基去除 Y-27632。此后，最初每隔一天更换一次培养基，并在细胞达到更高的汇合度时每天更换一次。

5. iPS 细胞分化为运动神经元

1. 用于运动神经元分化的 iPSC 传代
   注意: 分化可以在 3D （5.2） 协议中成功进行。
   1. 让未分化的 iPS 细胞生长，直到它们在 6 孔板中的 mTeSR Plus 培养基中达到约 80% 的汇合度。
   2. 完全吸出培养基。立即用无菌 PBS 洗涤孔一次，并向细胞中加入 0.5 mL 细胞解离溶液。
   3. 将板在37°C下在培养箱中孵育约2-3分钟，或直到细胞分离并呈圆形，但仍附着在孔上。
   4. 加入 1 mL 培养基，并使用 5 mL 血清移液器轻轻上下移液几次。将细胞悬液转移至由 4 mL 培养基组成的 15 mL 试管中。
   5. 以 200 x g 离心 3 分钟。
   6. 小心吸出上清液，让沉淀不受干扰，并将细胞重悬于 1 mL 补充有 10 μM Y-27632 的培养基中。
   7. 使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后进行 5.2 （3D 分化）。
在
2. 3D 分化中形成运动神经元球体 （MNS）（"3D 方案"）
   注意: 从分化的第 0-12 天开始每天进行完全培养基更换（图 2）。
   1. 将步骤 5.1.7 中的 iPS 细胞以 40,000 个细胞/孔的密度接种到 96 孔 U 底板中，溶于 100 μL 补充有 10 μM Y-27632 的 mTeSR Plus 中。
   2. 第二天，用 100 μL 新鲜培养基替换每个孔。
   3. 第 0 天和第 1 天:吸出培养基并替换为 100 μL 补充有 10 μM SB431542 和 100 nM LDN-193189 的 KSR 培养基 （3.1.2）。
   4. 第 2 天和第 3 天:吸出培养基并替换为 100 μL KSR 培养基，其中补充有 10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA 和 1 μM SAG。
   5. 第 4 天和第 5 天:准备由 75% KSR 培养基和 25% N2 培养基 （3.1.3） 组成的混合培养基。然后，吸出培养基并替换为 100 μL 补充有 10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA 和 1 μM SAG 的混合培养基。
   6. 第 6 天和第 7 天:准备由 50% KSR 培养基和 50% N2 培养基组成的混合培养基。然后，吸出培养基并用 100 μL 补充有 5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM 视黄酸和 1 μM SAG 的混合培养基替换。
   7. 第 8 天和第 9 天:准备由 25% KSR 培养基和 75% N2 培养基组成的混合培养基。然后，吸出培养基并替换为 100 μL 补充有 5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA 和 1 μM SAG 的混合培养基。
   8. 第 10 天和第 11 天:用 100 μl 补充有 5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA 和 1 μM SAG 的 N2 培养基替换培养基。
   9. 第 12 天:继续将 MN 转移到组织培养芯片中（步骤 6）或用 100 μL 补充有 20 ng/mL 脑源性神经营养因子 （BDNF） 的成熟培养基 （3.1.4） 替换培养基><。 注意:MNS 可以从第 12 天到第 19 天转移到组织培养芯片上。未转移的球体应在补充有 20 ng/mL BDNF 的成熟培养基中的 96 孔 U 底板中培养，直至转移。

6. 制备用于运动神经类器官 （MNO） 形成的组织培养芯片

1. 通过将制备的 PDMS 浸入培养皿中的 70% 乙醇中至少 1 小时
   对制备的 PDMS 进行消毒 注意:以下所有步骤都应在生物安全柜中进行作。
2. 通过将显微镜玻璃 （76 x 52 mm） 浸入培养皿中的 70% 乙醇中对显微镜玻璃 （76 x 52 mm） 进行消毒。
3. 在显微镜玻璃的干燥过程中，将 PDMS 设备放在半湿显微镜玻璃上，等待过夜使其完全干燥。一旦完全干燥，PDMS 设备应粘附在玻璃上。
   注意: 这种粘合不是永久性的，因此在组织采集培养后，PDMS 设备会从显微镜玻璃上分离。氧等离子体的永久粘合可用于最大限度地提高 PDMS 和玻璃之间的粘合力，但它会禁止拆卸芯片和组织收集。
4. 通过在通道入口的一侧制作液滴，在 PDMS 设备和显微镜玻璃中涂上 30 μL 稀释的 DMEM/F12 （1:40） 基底膜基质，然后从入口的另一侧吸出溶液用移液器或抽吸泵（图 3A）。请勿吸出过多体积的溶液，以免污染气泡。
5. 然后，将 PDMS 设备在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 下在辅助容器（例如培养皿）中过夜。

7. 运动神经类器官 （MNO） 形成

1. 在使用前，用预热的 150 μL 成熟培养基补充 20 ng/mL BDNF 替换涂层溶液。
2. 然后，使用带有大口径尖端的微量移液器将步骤 5.2.9 中的 MNS 放入微通道的入口中。MNS 可以通过重力自发地沉降在装置的底部。注射 MNS 时不要施加太大的压力（图 3B><）。 注意: 如果 MNS 卡在组织培养芯片孔的侧壁上，请从入口的另一侧轻轻吸出溶液。
3. 用无菌水填充一个小储液槽（例如，15 mL 试管的盖子），并将其放在二级容器中的组织培养芯片附近，以防止培养基蒸发。然后，将其置于 5% CO 2 / 37°C 培养箱中。
4. 要更换培养基，请从培养基储液器的中心吸出用完的培养基（图 3C）。不要吸出所有培养基和组织。
5. 轻轻加入新鲜的成熟培养基（含 BDNF）。培养基应每 2-3 天更换一次。在培养过程中的任何时候都不要干燥培养基。轴突从 MNS 长入通道，并在 2-3 周内自发组装成一个束，从而形成 MNO。MNO 可以在设备中额外培养 1 个月以上。

结果

图 1:PDMS 组织培养芯片的尺寸。

（A） 组织培养芯片的光掩模。（B） 组织培养芯片中微通道的尺寸。用于固定运动神经元球体的基腔直径为 2 mm，腔室上方的 PDMS 孔为 1.5 mm。桥接两个腔室的微通道的宽度和高度均为 150 μm。

图 2:运动神经元分化的示意图。

（A） 分化步骤涉及神经诱导...

材料