利用微流控芯片开发人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官

摘要

来源：Osaki, T., 等。三维运动神经类器官的生成。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了通过以下步骤创建运动神经类器官的方法：首先将人诱导多能干细胞在特定培养基中培养形成球状体，然后利用特定抑制剂将其分化为运动神经元，最后在微流控芯片中进行培养，以促进轴突延伸并形成运动神经类器官。

方案

1. 通过光刻法制作SU-8模具

注意：本实验涉及危险化学品。全程须使用通风橱和个人防护装备。

1. 用丙酮清洗硅片（直径4英寸，厚度1毫米，抛光），并用氮气吹干。然后在180 °C下烘烤3分钟以彻底干燥。
2. 将3 mL SU-8 2100滴加到已清洁的硅片上。
3. 使用旋涂仪以500 rpm转速旋涂10秒，随后以300 rpm/s的加速度升至1500 rpm继续旋涂30秒，使SU-8在硅片表面均匀成膜，厚度约为150 µm。
   注意：确保硅片位于旋涂仪中心，并通过真空牢固固定。
4. 将硅片置于热板上进行前烘，依次在50 °C下加热10分钟，65 °C下加热7分钟，95 °C下加热45分钟。
5. 将光掩模（图1）安装至掩模对准器，并用365 nm紫外光曝光60秒。
   注意：曝光时间需根据紫外光剂量进行优化。
6. 曝光后，将硅片置于热板上，依次在65 °C下烘烤6分钟，95 °C下烘烤13分钟。
7. 将硅片放入SU-8显影液中，在轨道摇床上震荡显影10–20分钟，过程中更换一次显影液。
   注意：若仍有SU-8残留物，可适当延长显影时间。
8. 用异丙醇冲洗硅片，并用氮气轻轻吹干。
9. 使用测量显微镜测定SU-8薄膜的高度，确认其厚度约为150 µm。样品可在室温下长期保存。

2. 基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控组织培养芯片制备

1. 用双面胶带将涂有 SU-8 的晶圆固定在容器（例如 15 cm 塑料培养皿）中。
2. 使用氮气吹去晶圆表面的灰尘。
3. 进行硅烷化处理时，将涂有 SU-8 的晶圆与一个小容器（例如 35 mm 培养皿）一同放入真空腔室中。在小容器中滴加 10 µL 的（三氯硅烷基）十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1，切勿将该试剂直接施加到 SU-8 晶圆上。
4. 紧密关闭真空腔室，并开启真空泵至少 2 小时。
5. 取一个塑料杯，按 10:1 的质量比倒入硅胶弹性体（例如 Silpot 184 或等效的 Sylgard 184）和固化剂。用刮刀充分混合后，在真空腔室中脱气，直至完全去除气泡。
6. 将 PDMS 混合物倒入装有 SU-8 晶圆的容器中，达到所需厚度（3–4 mm），再次进行脱气以去除气泡。
7. 将 PDMS 在 60 °C 烤箱中烘烤至少 3 小时，以完全固化 PDMS。
8. 冷却后，使用解剖刀或剃刀片将固化的 PDMS 从晶圆上剥离下来。
9. 为构建组织培养芯片的两个腔室，使用直径为 1.5 mm 的活检打孔器在芯片上对应两个隔室的位置打两个孔。
10. 为制备培养基储液池，另配制一份 PDMS 混合物（硅胶弹性体与固化剂按 10:1 质量比混合），倒入一个新的 10 cm 培养皿中。控制浇注量，使 PDMS 厚度约为 5 mm。
11. 将 PDMS 在 60 °C 烤箱中烘烤至少 3 小时，使其完全固化。
12. 冷却后，用解剖刀将固化的 PDMS 切割成矩形环状。
13. 通过在底层与储液池之间涂布未固化的 PDMS 并对组装好的 PDMS 层进行烘烤，实现两者的键合。该键合结构即形成 PDMS 组织培养芯片。
14. 使用透明胶带清洁 PDMS 组织培养芯片表面，以去除灰尘和微小颗粒。若避免灰尘和紫外光暴露，PDMS 组织培养芯片可在室温下长期保存。

3. 培养物的制备

1. 培养基
   注意：以下所列的所有培养基均应经过滤灭菌，除非另有说明。制备好的培养基可在 4 °C 保存，并在一个月内使用。
   1. 制备 mTeSR Plus 培养基：将一瓶 100 mL 的 mTeSR Plus 5x 添加剂与一瓶 400 mL 的 mTeSR Plus 基础培养基混合。
   2. 制备 100 mL KSR 培养基：在 85 mL 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）或 DMEM/F12 中，加入 15 mL 的 Knockout 血清替代物（KSR，15%）、1 mL 的商用谷氨酰胺补充剂（1%）以及 1 mL 的非必需氨基酸（NEAA，1%）。
   3. 制备 100 mL N2 培养基：在 100 mL 的 Neurobasal 培养基中，加入 1 mL 的 N2（100 倍浓缩液）、1 mL 的商用谷氨酰胺补充剂和 1 mL 的 NEAA。
   4. 制备 250 mL 成熟培养基：在 250 mL 的 Neurobasal 培养基中，加入 5 mL 的 B27（2%）、2.5 mL 的商用谷氨酰胺补充剂（1%）以及 2.5 mL 的青霉素/链霉素（1%）。
   5. 将化合物（视黄酸（RA）、SB431542、LDN-193189、SU5402、DAPT、SAG、Y-27632）用细胞培养级 DMSO 溶解至所需浓度。分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。以下为所用的储存液浓度：1 mM RA、10 mM SB431542、100 μM LDN-193189、10 mM SU5402、10 mM DAPT、1 mM SAG、10 mM Y-27632。
2. 包被
   注意：为防止基底膜基质因受热而发生聚合，应避免反复冻融。所有包被操作应尽可能使用预冷的移液枪头和离心管。基底膜基质应在 4 °C 过夜解冻，并使用预冷的枪头和离心管进行分装。分装后的基质可于 -20 °C 或 -80 °C 冻存。
   1. 在冰上于 4 °C 解冻冻存的分装液。包被过程中应始终保持低温。使用预冷的移液枪头，按 1:40 的比例将基底膜基质用冰上预冷的 DMEM/F12 稀释。未用完的稀释后基底膜基质可在 4 °C 保存 2–3 天，前提是未发生聚合。
   2. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 基底膜基质/DMEM-F12 溶液以进行包被。
   3. 将培养板在室温下孵育至少 1 小时，或在 4 °C 过夜。包被好的培养板可在 4 °C 最长保存一周。

iPS 细胞的维持

1. 按照步骤 3.2 中所述方法制备包被基底膜基质的培养皿。
2. 完全吸除 mTeSR Plus 培养基。用 PBS 洗涤一次，加入 0.5 mL 传代试剂（见材料表）。静置数秒后吸除溶液。
3. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，或直至细胞变圆。
   注意：不同 iPS 细胞系及不同汇合度下，孵育时间可能有所差异。请在孵育过程中定期在显微镜下观察，以确定合适的解离时间。
4. 加入 1 mL mTeSR Plus 培养基，轻敲培养板 30–60 秒，使细胞集落脱落。
5. 将 1 mL 细胞悬液轻轻混匀于 7 mL 新鲜 mTeSR Plus 培养基中。吹打次数不要超过 5 次。
6. 按 1:8 的比例接种。通常取步骤 5.5 中的 1 mL 悬液，加入 1 mL 含 5–10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂）的 mTeSR Plus 培养基。传代稀释比例取决于 iPSC 细胞系。
7. 将细胞置于 5% CO2 / 37 °C 培养箱中培养。次日通过更换新鲜 mTeSR Plus 培养基去除 Y-27632。此后初期每隔一天换液一次，当细胞汇合度升高后改为每天换液。

iPS细胞向运动神经元的分化

1. 用于运动神经元分化的iPSC传代
   注意：分化可成功采用三维（5.2）方案进行。
   1. 在6孔板中使用mTeSR Plus培养基培养未分化的iPS细胞，直至其融合度达到约80%。
   2. 完全吸除培养基。立即用无菌PBS洗涤孔内细胞一次，然后加入0.5 mL细胞解离液。
   3. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育约2-3分钟，或直至细胞分离变圆但仍附着于孔底。
   4. 加入1 mL培养基，使用5 mL移液管轻轻吹打数次。将细胞悬液转移至含有4 mL培养基的15 mL离心管中。
   5. 在200 x g 条件下离心3分钟。
   6. 小心吸除上清液，保留细胞沉淀，用1 mL添加了10 µM Y-27632的培养基重悬细胞。
   7. 使用血细胞计数板对细胞计数，并继续进行步骤5.2（三维分化）。
2. 三维分化中运动神经元类球体（MNS）的形成（“三维方案”）
   注意：从分化第0天至第12天每日进行完全换液（图2）。
   1. 将步骤5.1.7获得的iPS细胞以每孔40,000个细胞、共100 µL mTeSR Plus培养基（添加10 µM Y-27632）接种至96孔U型底板。
   2. 次日，每孔更换100 µL新鲜培养基。
   3. 第0天和第1天：吸除培养基，每孔加入含10 µM SB431542和100 nM LDN-193189的100 µL KSR培养基（3.1.2）。
   4. 第2天和第3天：吸除培养基，每孔加入含10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的100 µL KSR培养基。
   5. 第4天和第5天：配制由75% KSR培养基和25% N2培养基（3.1.3）组成的混合培养基。吸除原培养基，每孔加入含10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的100 µL混合培养基。
   6. 第6天和第7天：配制由50% KSR培养基和50% N2培养基组成的混合培养基。吸除原培养基，每孔加入含5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM视黄酸和1 µM SAG的100 µL混合培养基。
   7. 第8天和第9天：配制由25% KSR培养基和75% N2培养基组成的混合培养基。吸除原培养基，每孔加入含5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的100 µL混合培养基。
   8. 第10天和第11天：每孔更换为含5 µM DAPT、5 µM SU5402、1 µM RA和1 µM SAG的100 µL N2培养基。
   9. 第12天：将MNS转移至组织培养芯片（步骤6），或更换为含20 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）的100 µL成熟培养基（3.1.4）。
      注意：MNS可在第12天至第19天之间转移至组织培养芯片。未转移的类球体应继续在含20 ng/mL BDNF的成熟培养基中，于96孔U型底板中培养直至转移。

6. 运动神经类器官（MNO）形成的组织培养芯片制备

1. 将制备好的PDMS（来自步骤2.13）浸入培养皿中的70%乙醇中，至少浸泡1小时以进行灭菌。
   注意：所有后续操作均应在生物安全柜中进行。
2. 将显微镜载玻片（76 × 52 mm）浸入培养皿中的70%乙醇中进行灭菌。
3. 在显微镜载玻片干燥过程中，将PDMS装置置于半湿润的载玻片上，并静置过夜使其完全干燥。完全干燥后，PDMS装置应粘附于玻片表面。
   注意：该粘附方式并非永久性，以便在培养结束后将PDMS装置从载玻片上剥离，用于组织收集。若使用氧气等离子体进行永久性键合，可增强PDMS与玻璃之间的粘附力，但会阻碍芯片拆卸及组织采集。
4. 用移液器或抽吸泵，在微通道的入口一侧滴加30 μL以DMEM/F12培养基稀释的基底膜基质溶液（1:40），从另一侧抽吸，使溶液覆盖PDMS装置及显微镜载玻片上的微通道表面（图3A）。抽吸时避免过度吸取溶液，以防引入气泡污染。
5. 随后，将PDMS装置置于次级容器（例如培养皿）中，在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。

7. 运动神经类器官（MNO）的形成

1. 使用前，将包被液更换为预热的150 µL成熟培养基，并添加20 ng/mL BDNF。
2. 然后，使用带宽口吸头的移液器将第5.2.9步中的运动神经球（MNS）放入微通道的入口。MNS可通过重力自然沉降到装置底部。注入MNS时切勿施加过大压力（图3B）。
   注意：若MNS卡在组织培养芯片孔的侧壁上，可从入口的另一侧轻轻抽吸溶液。
3. 用无菌水填充一个小的储液槽（例如15 mL离心管的管盖），并将其放置在组织培养芯片附近的次级容器中，以防止培养基蒸发。然后将装置置于5% CO2、37 °C的培养箱中。
4. 更换培养基时，从培养基储液区中央吸取废弃的培养液（图3C）。切勿将培养基和组织全部吸除。
5. 轻柔加入新鲜的成熟培养基（含BDNF）。每2–3天更换一次培养基。培养过程中任何时候均不得使培养基干燥。轴突将在2–3周内从MNS延伸进入通道，并自发组装成单一束状结构，从而形成运动神经束（MNO）。MNO可在该装置中继续培养超过1个月。

结果

图 1：PDMS 组织培养芯片的尺寸。

（A）组织培养芯片的光刻掩模。（B）组织培养芯片中微通道的尺寸。用于容纳运动神经元球体的基底腔室直径为 2 mm，PDMS 腔室上方的孔径为 1.5 mm。连接两个腔室的微通道宽度和高度均为 150 μm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷	Sigma	440302
200µl 宽口吸头	BMBio	BMT-200WRS
6孔板	Violamo	2-8588-01
Accutase	ICT	AT104
B-27 补充剂（50X）	Gibco	17504044
脑源性神经营养因子（BDNF）	和光	020-12913
CO2培养箱	松下	MCO-18AIC
DAPT	Sigma	D5942
DMEM/F12	Sigma	D8437
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-061
生长因子减少型基质胶（基底膜基质）	康宁	354230
异丙醇（IPA）	和光	166-04836
Knock Out血清替代物	Gibco	10828028
LDN193189	Sigma	SML0559
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）（NEAA）	Sigma	M7145
显微镜玻璃	Matsunami	S9111
mTeSR Plus	干细胞技术	5825
N2 补充剂	和光	141-08941
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
96U 表面活化	住友电木	MS-9096U
ReLeSR（传代试剂）	干细胞技术	5872
视黄酸	和光	186-01114
SAG	Sigma	SML1314
SB431542	和光	192-16541
硅片	SUMCO	PW-100-100
Silpot 184 w/c 套件	Dow Toray	Silpot 184 w/c 套件
Smi32 抗体	Biolegend	801701
SU5402	Sigma	SML0443
SU-8 显影液	微化学	Y020100
不含酚红的TrypLE Express液体（解离液）	Gibco	12604-021
Y-27632	和光	030-24021