使用冷常压等离子体处理刺激神经干细胞分化

Abstract

来源:Xiong， Z.， et al. 通过一步冷常压等离子体体外处理进行神经干细胞分化。 （2019 年）。

该视频介绍了一种利用低温大气血浆触发神经干细胞分化的方法。这会产生紫外线辐射和反应分子，刺激神经细胞产生投射，表明神经元细胞分化。

Protocol

1. 细胞培养和预分化

1. 神经干细胞培养和预分化
   1. 准备聚-D-赖氨酸包被的盖玻片。将无菌盖玻片（直径 20 mm）放入 12 孔板中。按照以下步骤，在水中涂覆 0.1% 聚 D-赖氨酸，以更好地粘附在盖玻片上。
      注:必须为每种细胞系和应用确定最佳条件。
      1. 在无菌条件下用 0.1% w/v 的聚-D-赖氨酸溶于水中涂覆盖玻片表面。轻轻摇动以确保盖玻片表面均匀涂覆。
      2. 在 37°C 下培养过夜（~12 小时）后，去除多聚-D-赖氨酸溶液，并用 1 mL 无菌水冲洗表面 3 次。
      在
      3. 接种细胞前至少 30 分钟干燥细胞。
2. 小鼠神经干细胞 C17.2 （C17.2-NSC） 培养和预分化
   1. 在 25 cm² 培养瓶中，在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、5% 马血清 （HS） 和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 C17.2-NSCs~2 - 3 天。
   2. 当细胞达到 85% 汇合时，取出培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞，并向培养瓶中加入 1 mL 新鲜胰蛋白酶 （0.25%）。放置 1 分钟;然后，向培养瓶中加入 1 mL 培养基，并上下移液数次，以确保单细胞悬液。
   3. 使用血细胞计数器计数悬浮液中细胞的密度。计算所需的细胞悬液体积，得到最终细胞浓度为 2 x 10⁴ 个细胞/mL。
   4. 将 C17.2-NSCs 接种在 12 孔板中的包被盖玻片上，密度为 ~2 x 10⁴ 个细胞/孔。在显微镜下检查细胞密度。
      注:为了获得更好的结果，必须在免疫荧光实验之前确定最佳细胞密度。
   5. 将细胞在 37°C 下在细胞培养箱中孵育 12 小时以允许贴壁。
   6. 附着后，用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次，并在血浆处理前用由 DMEM/F12 和 1% N2 补充剂组成的分化培养基培养细胞 48 小时。
3. 原代大鼠神经干细胞培养和预分化
   在
   1. 未包被的 T25 培养瓶中的大鼠 NSC 生长培养基中以 5 x 10⁵ 个细胞的密度培养原代大鼠 NSC（神经干细胞）悬浮液。
   2. 在倒置显微镜下检查神经球的形成。确保神经球的形态表现出球形和透明的多细胞复合物。
   3. 当神经球直径达到 3 mm 或更大时，将神经球悬液转移到 15 mL 无菌离心管中，让神经球在重力作用下沉降。
   4. 小心去除上清液，将神经球留在最小体积的培养基中。
   5. 用 5 mL PBS 冲洗神经球 1 次，让神经球在重力作用下沉降。去除上清液以留下最小体积的 PBS。
   6. 添加适当体积的分化培养基，将细胞密度调节至每毫升 ~12 - 15 个神经球。原代大鼠 NSCs 的分化培养基由 DMEM/F12、2% B27 和 1% FBS 组成。
   7. 将 1 mL 神经球悬液接种到 12 孔板中的每个涂层盖玻片上。
      注意:轻轻摇晃板以确保神经球均匀分布。此步骤对于获得更好的免疫荧光结果至关重要。
   8. 将板放入培养箱中，并在血浆处理前使其预分化 24 小时。

2. 等离子体射流的准备

1. 选择内径为 2 mm、外径为 4 mm 的半开石英管。将直径为 2 mm 的高压线插入管中。
将
2. 带有高压线的石英管插入 5 mL 注射器中，并使用支架将其安装在注射器中心内。将石英管密封端与注射器尖端之间的距离设置为 1 cm。
3. 将一根 1 m 的硅橡胶管（内径为 12 mm）连接到注射器的开口端，然后依次将其连接到流量计和燃气阀。

3. 收购喷气机队

1. 如图 1 所示连接电路。将电源的输出线连接到等离子喷射设备，然后将高压探头的尖端与输出线连接以检测电压。将高压探头的另一端连接到示波器，记录输出电压的信息。检查整个电路，确保电源、示波器和高压探头都接地。
2. 检查燃气管线。确保气管已连接到等离子喷射装置;然后，打开氦气（体积分数，99.999%）和氧气（体积分数，99.999%）的气阀，将气体流量设置为 1 L:0.01 L/min （He:O₂）.
   注意: 在第一次打开电源之前，让气体流动几分钟。
3. 将脉冲幅度、频率和脉冲宽度分别设置为 8 kV、8 kHz 和 1600 ns。再次检查电路，然后打开输出按钮以创建等离子喷射器。
   注意: 任何时候都不要触摸高压线。

4. 神经干细胞的血浆处理

1. 将注射器喷嘴与细胞孔之间的距离设置为 15 mm.
   注意:距离是从放置 12 孔板的平台底部开始测量的。
2. 从培养箱中取出 12 孔板，将预分化细胞的培养基更换为 800 μL 新鲜分化培养基。
3. 将细胞分为三组:未处理的对照组、60 秒 He-and-O₂ （1%） 气流处理组和 60 秒血浆处理组><。 注:在处理条件下无明显的液体损失。
4. 将 12 孔板放在等离子体喷射器下方，确保注射器喷嘴固定在每个孔的中心，并对步骤 4.3.
   中提到的不同组进行相关处理 注:在实验过程中，未处理的对照在室温下保存在分化培养基中，以确保处理条件均匀。He-and-O₂ （1%） 气流处理组仅用 He 和 O₂ （1%） 气流处理，没有产生血浆。所有治疗都应一式三份进行。

5. 神经干细胞分化

1. 处理后，去除原始培养物并向每个孔中加入 1 mL 新的分化培养基。
2. 将细胞在培养箱中在 37°C 和 5% CO2 下孵育 6 天。每隔一天更换一次培养基。
3. 每天在倒置相差光学显微镜下检查不同组的分化状态 图 2.随机选择至少 12 个田地并拍照以记录形态变化。

Results

图 1:实验装置示意图。等离子喷射装置连接到高压电源的输出线。带示波器的高压探头用于检测输出电压。当工作气体流过注射器并且高压打开时，将产生等离子射流并传播到空气中。

图 2:C17.2-NSC 和原代大鼠 NSC 的普通倒置相差光学显微镜图像。此图经许可改编自 Xiong 等人。

Materials