利用冷大气等离子体处理促进神经干细胞分化

摘要

来源：Xiong, Z., 等 体外通过一步冷大气等离子体处理诱导神经干细胞分化。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了一种利用低温大气等离子体诱导神经干细胞分化的实验方法。该方法通过产生紫外辐射和活性分子，刺激神经细胞长出突起，表明神经元细胞发生了分化。

方案

1. 细胞培养与预分化

1. 神经干细胞培养与预分化
   1. 准备多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片。将一个无菌盖玻片（直径 20 mm）放入 12 孔板中。使用水配制的 0.1% w/v 多聚-D-赖氨酸对盖玻片进行包被，以增强细胞在盖玻片上的黏附性，具体操作步骤如下：
      ​注意：每种细胞系和应用需确定最佳条件。
      1. 在无菌条件下，用 0.1% w/v 的多聚-D-赖氨酸水溶液包被盖玻片表面，轻轻摇晃以确保包被均匀。
      2. 在 37°C 下孵育过夜（约 12 小时）后，移除多聚-D-赖氨酸溶液，并用 1 mL 无菌水冲洗表面 3 次。
      3. 在接种细胞前，至少干燥 30 分钟。
2. 小鼠神经干细胞 C17.2（C17.2-NSC）培养与预分化
   1. 将 C17.2-NSCs 在含 10% 胎牛血清（FBS）、5% 马血清（HS）和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 条件下，在 25 cm² 培养瓶中孵育约 2–3 天。
   2. 当细胞达到 85% 汇合度时，移除培养基，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后向培养瓶中加入 1 mL 新鲜胰蛋白酶（0.25%），静置 1 分钟；随后向培养瓶中加入 1 mL 培养基，并反复吹打数次，以确保形成单细胞悬液。
   3. 使用血细胞计数板测定悬液中的细胞密度。计算所需细胞悬液体积，使最终细胞浓度为 2 × 10⁴ 个细胞/mL。
   4. 将 C17.2-NSCs 以约 2 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种至 12 孔板中的包被盖玻片上。在显微镜下检查细胞密度。
      注意：为获得更佳结果，应在免疫荧光实验前确定最佳细胞密度。
   5. 将细胞置于 37°C 细胞培养箱中孵育 12 小时，以促进细胞贴壁。
   6. 贴壁后，用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次，然后使用含 1% N2 添加剂的 DMEM/F12 分化培养基培养 48 小时，再进行等离子体处理。
3. 大鼠原代神经干细胞培养与预分化
   1. 将大鼠原代 NSC（神经干细胞）悬液以 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于未包被的 T25 培养瓶中，在大鼠 NSC 增殖培养基中进行培养。
   2. 在倒置显微镜下观察神经球的形成情况。确保神经球形态呈透明、球形的多细胞复合体。
   3. 当神经球直径达到 3 mm 或更大时，将神经球悬液转移至 15 mL 无菌离心管中，静置使神经球自然沉降。
   4. 小心移除上清液，保留神经球于最小体积的培养基中。
   5. 用 5 mL PBS 冲洗神经球 1 次，静置使神经球沉降，然后移除上清液，保留少量 PBS。
   6. 加入适量分化培养基，调整细胞密度至每毫升约含 12–15 个神经球。大鼠原代 NSC 的分化培养基成分为 DMEM/F12、2% B27 和 1% FBS。
   7. 将 1 mL 神经球悬液接种至 12 孔板中每个包被的盖玻片上。
      注意：轻轻摇动培养板，确保神经球均匀分布。此步骤对获得良好的免疫荧光结果至关重要。
   8. 将培养板放入培养箱中，在等离子体处理前预分化 24 小时。

2. 等离子体射流的制备

1. 选择一根内径为 2 mm、外径为 4 mm 的半开口石英管。将一根直径为 2 mm 的高压导线插入该石英管中。
2. 将带有高压导线的石英管插入一个 5 mL 的注射器中，并使用支架将其固定在注射器中心位置。调节石英管封闭端与注射器尖端之间的距离为 1 cm。
3. 将一段长 1 m、内径为 12 mm 的硅橡胶管连接到注射器的开口端，然后依次连接至流量计和气体阀门。

3. 射流的获取

1. 按照图1所示连接电路。将电源的输出线连接到等离子体射流装置，然后将高压探头的探针连接到输出线上以检测电压。将高压探头的另一端连接至示波器，以记录输出电压信息。检查整个电路，确保电源、示波器和高压探头均已接地。
2. 检查气体管路。确认气体管路已连接至等离子体射流装置；然后打开氦气（体积分数99.999%）和氧气（体积分数99.999%）的气阀，并将气体流速设定为1 L : 0.01 L/min（He:O₂）。
   注意：首次开启电源前，先让气体持续流动数分钟。
3. 将脉冲幅值、频率和脉冲宽度分别设置为8 kV、8 kHz和1600 ns。再次检查电路，然后打开输出按钮以产生等离子体射流。
   警告：任何时候均不得触碰高压导线。

4. 神经干细胞的等离子体处理

1. 将注射器喷嘴与细胞培养板孔之间的距离设置为 15 mm。
   注意：该距离是从放置 12 孔板的平台底部开始测量的。
2. 从培养箱中取出 12 孔板，将预分化细胞的培养基更换为 800 µL 新鲜的分化培养基。
3. 将细胞分为三组：未处理对照组、60 秒 He 和 O₂ (1%) 气体流处理组，以及 60 秒等离子体处理组。
   注意：在处理条件下无明显液体损失。
4. 将 12 孔板置于等离子体射流下方，确保注射器喷嘴固定在每个孔的中心位置，并对步骤 4.3 中提到的不同组别进行相应处理。
   注意：在实验过程中，未处理对照组保持在室温下的分化培养基中，以确保处理条件的一致性。He 和 O₂ (1%) 气体流处理组仅接受 He 与 O₂ (1%) 气体流处理，不产生等离子体。所有处理均应设三个重复。

5. 神经干细胞分化

1. 处理后，移除原有培养基，向每孔加入 1 mL 新的分化培养基。
2. 将细胞置于 37°C、5% CO2 的培养箱中培养 6 天，每隔一天更换一次培养基。
3. 每天在倒置相差显微镜下观察各组细胞的分化情况 图 2，随机选取至少 12 个视野拍照，记录形态学变化。

结果

图1：实验装置示意图。 等离子体射流装置连接至高压电源的输出导线。通过带示波器的高压探头检测输出电压。当工作气体流经注射器且施加高压时，将产生等离子体射流并传播至开放空气中。

图 2：C17.2 神经干细胞和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片	NEST	801008
多聚-D-赖氨酸	Beyotime	P0128
DMEM 培养基	HyClone	SH30022.01B	4 °C 保存
DMEM/F12 培养基	HyClone	SH30023.01B	4 °C 保存
N2 添加剂	Gibco	17502048	-20 °C 保存，避光
B27 添加剂	Gibco	17504044	-20 °C 保存，避光
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	-20 °C 保存，避免反复冻融
供体马血清	HyClone	SH30074.03	-20 °C 保存，避免反复冻融
青霉素/链霉素	HyClone	SV30010	4 °C 保存
胰蛋白酶	HyClone	25300054	4 °C 保存
PBS 溶液	HyClone	SH30256.01B	4 °C 保存
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0098	-20 °C 保存
吐温-100	Sigma	T8787
光学显微镜	南京江南永新光学有限公司	XD-202
高压功率放大器	Directed Energy	PVX-4110
直流电源	Spellman	SL1200
函数发生器	Aligent	33521A
示波器	Tektronix	DPO3034
高压探头	Tektronix	P6015A
12 孔板	corning	3512
25 cm² 培养瓶	corning	430639
氦气
氧气
等离子体射流喷嘴
CO₂ 培养箱
硅胶管			内径 12 mm
小鼠神经干细胞 C17.2 (C17.2-NSC)